Бактериологический метод

Бактериологический (культуральный) метод выявления МБТ заключается в посеве мокроты и другого патологического материала на питательные среды. Для эффективного выделения культуры МБТ достаточно единичных жизнеспособных бактериальных клеток (20-100 микробных тел) в образце диагностического материала. Рост культуры регистрируют за 21 —90 дней.

Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить 3 основные группы:

• плотные питательные среды на яичной основе;

• плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе;

• жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды.

В России наиболее широкое распространение получила плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Среду Левенштейна—Йенсена применяют во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Рост МБТ на этой среде появляется в диапазоне 3 нед-3 мес (в среднем 1,5 мес).

Вирулентные культуры МБТ обычно растут на плотных питательных средах в виде R-колоний (от англ, rough — грубый, шершавый) различной величины и вида, имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет ), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту (рис. 5.3, см. цветную вклейку). 

Интенсивность роста определяют по 3-балльной системе:

• «+» — 1-20 колоний (скудное бактериовыделение);

• «++» — 21—100 колоний (умеренное бактериовыделение);

• «+++» — более 100 колоний (обильное бактериовыделение).

Лекарственную устойчивость МБТопределяют методом абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена, основанной на добавлении определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл.

Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 107 микробных тел.

Уровень устойчивости данного штамма МБТ в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение МБТ. Для различных противотуберкулезных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма.

Для метода абсолютных концентраций появление более 20 колоний на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат в критической концентрации, свидетельствует о том, что данный штамм МБТ обладает лекарственной устойчивостью.

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов при определении лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна—Йенсена составляют:

• для изониазида — 1 мкг/мл;

• для рифампицина — 40 мкг/мл;

• для пиразинамида — 200 мкг/мл;

• для этамбутола — 2 мкг/мл;

• для стрептомицина — 10 мкг/мл;

• для канамицина — 30 мкг/мл;

• для капреомицина — 30 мкг/мл;

•для протионамида (этионамида) — 30 мкг/мл;

•для циклосерина — 30 мкг/мл;

• для ПАСК — 1 мкг/мл;

• для офлоксацина — 2 мкг/мл.

В большинстве случаев метод абсолютных концентраций применяют для непрямого определения лекарственной устойчивости МВТ. Вначале высевают мокроту на твердые питательные среды и получают чистую культуру МВТ, которую пересевают на питательные среды, содержащие определенные концентрации противотуберкулезных препаратов. Поскольку сроки выделения МВТ на питательных средах составляют не менее 1,5 мес, результаты определения устойчивости указанным методом обычно получают не ранее чем через 2—2,5 мес после посева материала.

Помимо описанных выше классических методов культивирования МВТ и определения лекарственной устойчивости в России нашли свое применение следующие современные системы.

Система ВАСТЕС MGIT 960— индикаторные пробирки MGIT (M. Growth Indicator Tube) с жидкой средой Middlebrook 7Н9; содержат в придонной части флюоресцирующий индикатор (трис-4,7-дифкнил- 1,10-фенантролин рутениум хлорид пентагидрат), «погашенный» высокими концентрациями О,. В процессе роста МВТ поглощают 02, что сопровождается усилением свечения индикатора, интенсивность которого оценивают при помощи трансиллюминатора.

Наличие роста МВТ в системе ВАСТЕС регистрируют на 4-5-й нед от момента посева. В системе ВАСТЕС возможно более быстрое определение лекарственной устойчивости. Для этого в индикаторные пробирки добавляют те же абсолютные концентрации противотуберкулезных препаратов, что и при методе посева. Учет лекарственной устойчивости идет в течение 6-8 нед.

Полностью автоматизированный комплекс позволяет одновременно регистрировать рост МВТ и исследовать лекарственную чувствительность МВТ в 960 исследуемых образцах одновременно (рис 5.4).

В России в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарта на основе ПЦР создана тест-система «ТБ-Биочип», которая предназначена для определения точечного типа мутации, приводящей к устойчивости возбудителя туберкулеза к трем противотуберкулезным препаратам — рифампицину (ген rpoВ), изониазиду (ген katG) и офлоксацину (ген gyrA). Тест-система «ТБ- Биочип-1» позволяет обнаруживать не менее 95% рифампицин- и не менее 60% изониазид-устойчивых штаммов МБТ. Тест-система «ТБ- Биочип-2» позволяет обнаруживать не менее 50% офлоксацин-устойчивых штаммов МБТ (рис. 5.5, см. цветную вклейку).

Недостатки тест-системы «ТБ-Биочип»:

• определение лекарственной устойчивости МБТ только к трем противотуберкулезным препаратам;

• определение устойчивости к изониазиду только по гену katG, в то время как не менее 30% изониазид-устойчивых штаммов определяется по генам kasA, асрМ и inhA.

• неполное определение устойчивости к офлоксацину по гену gyrA, так как данный вид устойчивости возможен только при сочетании с геном gyrB.

Указанные недостатки не позволяют применять данную тест-систему в клинических условиях, где лечащему врачу необходимо знать полный спектр лекарственной чувствительности МБТ у конкретного больного. Однако в эпидемиологических исследованиях данная тест-система позволяет ориентировочно определять такой показатель как множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) МБТ к изониазиду и рифампицину, что необходимо для формирования региональных режимов химиотерапии у впервые выявленных больных туберкулезом.