Уравнение Михаэлиса — Ментен

Диаграмvа скорости реакции V как функции от концентрации [S].

Уравне́ние Михаэ́лиса — Ме́нтен — основное уравнение ферментативной кинетики, описывает зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом, от концентрации субстрата и фермента. Простейшая кинетическая схема, для которой справедливо уравнение Михаэлиса:

Уравнение имеет вид:

,

где

· — максимальная скорость реакции, равная ;

· — константа Михаэлиса, равная концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от максимальной;

· — концентрация субстрата.

Вывод уравнения

Вывод уравнения был впервые предложен Бриггсом и Холдейном. Вывод уравнения скорости ферментативной реакции, описываемой схемой Михаэлиса-Ментен.

Обозначения констант скоростей:

k₁ — константа скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса из фермента и субстрата

k_-1 — константа скорости реакции диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и субстрат

k₂ — константа скорости реакции превращения фермент-субстратного комплекса в фермент и продукт

Для фермент-субстратного комплекса применим метод квазистационарности, так как в подавляющем большинстве реакций константа скорости превращения фермент-субстратного комплекса в фермент и продукт много больше, чем константа скорости образования ферменто-субстратного комплекса из фермента и субстрата. Иными словами:

Учтем тот факт, что фермент, изначально находившийся только в свободной форме, в процессе реакции находится как в виде фермент-субстратного комплекса, так и в виде молекул свободного фермента. Таким образом:

[E]₀ = [E] + [ES]

Преобразуем это к виду:

[E] = [E]₀ − [ES]

И подставим в первое уравнение. После раскрытия скобок и группировки слагаемых получим следующее:

Выразим отсюда концентрацию фермент-субстратного комплекса:

Скорость ферментативной реакции в целом (то есть скорость образования продукта) представляет собой скорость распада фермент-субстратного комплекса по реакции первого порядка с константой k₂:

v = k₂[ES]

Подставим в эту формулу выражение, которое мы получили для концентрации ES. Получим:

Разделим числитель и знаменатель на k₁. В результате:

Выражение в знаменателе — (k_-1+k₂)/k₁ — называется константой Михаэлиса (K_m). Это кинетическая константа (с размерностью концентрации), которая равняется такой концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимального значения.

Для начальной стадии реакции можно пренебречь уменьшением концентрации субстрата. Тогда выражение для начальной скорости реакции будет выглядеть так:

Если k_-1>k₂, то на первой стадии ферментативной реакции с течением времени устанавливается равновесие (квазиравновесный режим протекания реакции), и в выражение для скорости ферментативной реакции входит уже не константа Михаэлиса, а субстратная константа K_S, характеризующая взаимодействие фермента с субстратом в равновесных условиях:

;

По значению K_S можно судить о химическом сродстве субстрата к ферменту.

Металлоферменты и ферменты, активируемые металлами
Металлоферменты содержат определенное количество ионов металлов, имеющих функциональное значение и остающихся связанными с молекулой фермента в ходе его очистки. Ферменты, активируемые металлами, связывают последние менее прочно, но для своей активности требуют добавления металлов в среду. Таким образом, разграничение между металлоферментами и ферментами, активируемыми металлами, основано на сродстве данного фермента к иону «своего» металла. Механизмы, основанные на участии ионов металлов в катализе, в обоих случаях, по-видимому, сходны.
Тройные комплексы фермент—металл — субстрат
Для тройных (трехкомпонентных) комплексов, включающих каталитический центр (Enz), ион металла (М) и субстрат (S) со стехиометрией 1:1:1, возможны четыре различных схемы образования:
Enz—S—М М —Enz—S
Комплекс с мостиковым Комплекс с мостиковым субстратом ферментом
М
Enz—M—S Enz|
S
Простой комплекс с Циклический комплекс
мостиковым металлом с мостиковым металлом
В случае ферментов, активируемых металлами, реализуются все четыре схемы. Для металлофермен-тов образование комплекса Enz—S—М невозможно, иначе они не могли бы удерживать металл в процессе очистки (они находятся в форме Enz — — М). Можно сформулировать три общих правила.
1. Большинство (но не все) киназ (АТР:фосфо-трансферазы) образуют комплексы с мостиковым субстратом типа Enz—нуклеозид—М.
2. Фосфотрансферазы, использующие в качестве субстрата пируват или фосфоенолпируват, другие ферменты, катализирующие реакции с участием фосфоенолпирувата, а также карбоксилазы образуют комплексы с мостиковым металлом.
3. Данный фермент может быть способен к образованию мостикового комплекса одного типа с одним субстратом и другого типа — с другим.
Комплексы с мостиковым ферментом(М —Enz—S)
Металлы в комплексах с мостиковым ферментом, по-видимому, выполняют структурную роль, поддерживая активную конформацию (примером служит глутаминсинтаза), или образуют мостик с другим субстратом (как в пируваткиназе). В пиру-ваткиназе ион металла играет не только структурную роль, но и удерживает один из субстратов (АТР) и активирует его:
А
Пируваткиназа—АТР
Креатин.
Комплексы с мостиковым субстратом
Образование тройных комплексов с мостиковым субстратом, которое наблюдается при взаимодействии ферментов с нуклеозидтрифосфатами, по-видимому, связано с выстеснением Н₂0 из координационной сферы металла, место которой занимает АТР:
АТР- + M(H₂0)²⁺_fi г± АТР—М(Н₂0)² \ + ЗН₂0.
Затем субстрат связывается с ферментом, образуя тройной комплекс:
АТР—М(Н₂0)²:, + Enz <± *± Enz —ATP—M(H₂0)²:_v
В фосфотрансферазных реакциях ионы металлов, как полагают, активируют атомы фосфора и образуют жесткий полифосфат-адениновый комплекс в соответствующей конформации, который включается в состав активного четырехкомпонентного комплекса.
Комплексы с мостиковым металлом
м
Enz-M-SnnnEnz |
S
Кристаллографические данные, а также анализ первичной структуры показывают, что в активных центрах многих белков в связывании металла участвует остаток гистидина (примерами служат кар-боксипептидаза А, цитохром с, рубредоксин, мет-миоглобин и метгемоглобин; см. гл. 6). Лимитирующей стадией образования бинарных (двухкомпо-нентных) комплексов Enz—М во многих случаях является вытеснение воды из координационной сферы иона металла. Активация многих пептидаз ионами металла является медленным процессом, длящимся несколько часов. Среди таких металлоферментов особое значение в живых системах имеют цитохромы и гемсодержащие ферменты, активными группировками которых служат железопорфириновые комплексы ( см. стр. [1]

Во многих металлоферментах, особенно катализирующих окислительно-восстановительные реакции, присутствуют именно металлы с переменной валентностью, действующие как акцепторы водорода, например железо, медь, марганец, молибден. Известно, что для активации таких ферментов, как ксантиноксидаза или нитроредуктаза, молибден должен быть в шестивалентном состоянии. [2]

Карбоксипептидаза - это металлофермент, содержащий один атом цинка на молекулу белка. Карбоксипептидаза катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи в белках и олигопеп-тидах и сложных эфиров а-оксикислот. По данным рентгеноструктурного анализа Карбоксипептидаза представляет собой глобулярный белок, в котором содержится один атом цинка, координированный двумя остатками гистидина. Кроме того, в состав активного центра входят карбоксильная ( Glu-270), фенольная ( Туг-248) и гуанидиновая ( Arg-145) группы. [3]

Ингибирует широкий набор металлоферментов, включая гидроге-назу и гемоглобины ( при низких конц. СО-инги-бирование, обратимое под действием света, характерно для цитохромокси-дазы и др. гемсодержащих белков. Карбонилы Си и др. металлов не чувствительны к свету. Моноксид углерода сильно токсичен для многих живых тканей и микроорганизмов. [4]

СОД относится к металлоферментам, у которых в активном центре происходит восстановление и окисление иона металла. [5]

Трехмерная структура химотрипсина.

Карбоксипептидаза А - это металлофермент, который, будучи экзопепти-дазой, гидролитически отщепляет С-концевые, прежде всего ароматические, остатки аминокислот. Для работы фермента необходим ион Zn2, который с некоторыми ограничениями может быть замещен на ионы других переходных металлов. [6]

Сравнительное изучение каталитических свойств различных металлоферментов в начале было главным образом ограничено оценкой их относительной каталитической активности. Однако детальное изучение катализа и связывания лиганда для серии металлоферментов может пролить свет на роль иона металла, если при отсутствии каталитической активности сохраняется связывание металла. [7]

Прочность связи фосфата с металлоферментом удивительно велика. Константа устойчивости комплекса, равная около 106 М 1 [51, 63, 76], выше, чем можно было бы ожидать для взаимодействия НРО f - и иона двухвалентного металла. Вероятно, вблизи иона цинка находится еще один катионный центр связывания, например протон аминогруппы боковой цепи аминокислоты, взаимодействующий с кислородными атомами фосфата. Образование фосфорилфермента при реакции с субстратом и НРО можно считать твердо установленным. После разрушения белка фосфат оказывается присоединенным к серину. Отсюда делается вывод о том, что в активном центре вблизи иона цинка находится остаток серина, ориентация которого делает возможной его атаку по фосфорильному атому присоединенного производного фосфата. Вполне вероятно, что фосфорильная группа, присоединенная к серину, сохраняет связь с ионом цинка. [8]

ЭКВ отчетливо проявляются в свойствах металлоферментов. Металлы служат кофакторами многих ферментов - в большинстве классов ферментов имеются металлозависимые. [9]

В части IV рассмотрены структуры металлоферментов и механизмы, посредством которых ионы металлов принимают участие в ферментативной активности, в частности, в разрыве связей. [10]

Малер [8] подчеркивает различия между металлоферментами, в которых металл прочно связан с белком ( по существу необратимо), и ферментами, активированными металлами, в которых связь металла с белком слаба и легкообратима. [11]

В настоящее время известно более 100 истинных металлоферментов, участвующих в большинстве реакций клеточного метаболизма. Многие из них передают электроны за счет металлов с переменной валентностью. В этом случае можно постулировать, что металл принимает непосредственное участие в осуществлении каталитического акта. [12]

Ферменты окислительно-восстановительного действия являются чаще всего металлоферментами, так как в качестве компонентов каталитически активных центров этих ферментов служат металлы. В истинных металлоферментах металл прочно связан в строго определенных стехиометрических соотношениях с теми или иными химическими группировками апофермента или со специальной группой небелковой природы. [13]

В этих же органах и тканях находятся соответствующие металлоферменты или ферменты, активируемые тем или иным металлом. Так, для меди, цинка, молибдена, селена, марганца критическим органом является печень; для марганца, кобальта - также и щитовидная железа; для кадмия и цинка - мужские половые железы и почки; для бериллия - костная ткань. Полагают также, что распределение металлов внутри клетки коррелирует с содержанием в ней металлосодержащих ферментов