Стрептококк группы В

Материалом для исследования у беременной женщины может быть среднесуточная порция мочи, кровь, выделения из влагалища (заднего свода). У младенцев (при подозрении на инфицирование) материалом для исследования может быть кровь, желудочный ас­пират, мазок из уха, моча, пробы с других участков, спинномозго­вая жидкость.

Штаммы стрептококка группы В быстро и постоянно растут на средах, обогащенных глюкозой, кровью или сывороткой. К другим методам диагностики относится обнаружение антигена в крови, спинномозговой жидкости и моче. Имеется ряд наборов промыш­ленного производства, основанных на разнообразных иммунологи­ческих методах выявления стрептококкового антигена группы В. Точные данные о проценте ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов у разных авторов варьируют, однако в целом эти тесты являются достаточно надежными. Особенно пригодны они в тех случаях, где высока вероятность их обнаружения. Как правило, методы обнаружения антигена — это экспресс-тесты, ко­торые занимают 30 минут. Многие современные полуавтоматичес­кие методы позволяют получить культуру грамположительных кокков во флаконе в течение суток. Обнаружение антигена груп­пы В во флаконе дает возможность быстро поставить ориентиро­вочный диагноз.

—----------------------------------- Глава 3 --------------------------------------- —

Сифилис

Для установления диагноза сифилиса используют как бактерио-скопическое, так и серологическое исследование крови.

Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболевания является прямая визуализация трепонемы. При пер­вичном сифилисе на бледную трепонему исследуют отделяемое эро-зивно-язвенных папулезных элементов в области половых органов, полости рта, в пунктате из регионарных лимфатических узлов. При вторичном сифилисе используется материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек. Для диагностики врож­денного сифилиса может быть использована амниотическая жидкость. При отрицательных результатах микроскопическое ис­следование повторяют либо до обнаружения бледной трепонемы, либо до подтверждения диагноза результатами серологического ис­следования. В последнее время для обнаружения ДНК бледной тре­понемы применяют ПЦР.

Серологические исследования крови основаны на определении антител, которые вырабатываются при сифилисе и классифициро­ваны как неспецифические и специфические антитела против тре-понем.

Специфические антитела против трепонем вырабатываются в ответ на инфекцию, вызываемую трепонемами. Как и при других инфекциях, вначале появляются антитела класса IgM, а затем — IgG-антитела. IgM-антитела можно выявить у пациентов с первич­ным, вторичным или врожденным сифилисом, а также при реин-фекции. В целом титры IgM-антител снижаются после лечения, однако скорость снижения зависит от стадии болезни, при которой проводилось лечение; антитела снижаются быстрее после ранее на­чатого лечения. При позднем или неполном лечении антитела мо­гут персистировать в течение длительного периода.

Образование IgG-антител следует за выработкой IgM-антител и обычно достигает более высокого уровня. Хотя титры IgG-антител могут со временем снижаться, они персистируют в течение всей жизни пациента даже при адекватном лечении.

Неспецифические антитела против трепонем включают анти­тела против группового антигена и кардиолипина (антилипидные антитела). Антилипидные антитела выявляются на ранних стади­ях течения инфекции и достигают высоких уровней к началу вторичного периода. После проведенного лечения титры антител снижаются до уровня, который зависит от стадии, при которой бы-

------------------------------- Глава 3 ------------------------------

ло начато лечение. Данные уровни могут снижаться по мере про-грессирования инфекции до поздней стадии (даже при отсутствии терапии). Реинфекция приводит к увеличению титров антител.

Существует множество тестов для количественной оценки анти­тел против липидов. Тесты фиксации комплемента (например, ре­акция Вассермана) в настоящее время в мире применяются очень редко, так как они не имеют преимуществ по сравнению с совре­менными тестами флоккуляции, тестом Venereae Disease Research Laboratory (VDRL) или экспресс-тестом, основанным на микропре­ципитации с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови (RPR), которые более простые, быстрые, а также дешевле в исполнении.

Скрининговые и подтверждающие тесты на сифилис представ­лены в таблице 3.1. Серологический скрининг проводится с помощью анализа крови, взятого в первый визит пациентки, с при­менением стандартных тестов — нетрепонемных, таких как VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) или RPR (Rapid Plasma Reagin). Эти тесты обнаруживают нетрепонемные антитела и явля­ются неспецифическими, поэтому все положительные или сомни­тельные результаты должны быть подтверждены с помощью специфических трепонемных тестов, таких как тест иммобилиза­ции Treponema pallidum (Treponemapallidum immobilization test — TPI) и реакция иммунофлюоресценции-абсорбции (FTA-ABS — fluorescent treponemal antibody absorption).

После того, как получен первичный положительный результат какого-либо теста по определению антилипидных антител, необхо­димо определить титры этих антител. Данные тесты обладают огра­ниченной специфичностью, но они пригодны для диагностики трепонемной инфекции, поскольку дают положительный результат в начальной стадии и являются достоверными маркерами активно­сти инфекционного процесса.

Достоверным способом оценки активности болезни является тест на IgM-антитела.

Кардиолипины широко распространены в природе, поэтому ан-тилипидные антитела не являются специфическими при трепонем­ной инфекции: позитивные результаты могут наблюдаться при других заболеваниях, а иногда и у здоровых людей.

В 1982 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) ре­комендовала применение двух тестов для скрининга на сифилис. Один из них предназначался для обнаружения липидного (VDRL), а второй — трепонемного антигена (RPR). Данная комбинация представляет собой оптимальный способ выявления всех стадий трепонемной инфекции — как леченной, так и не леченной. В то

---------------------------- Глава 3 ----------------------------------

Таблица 3.1. Серологические тесты, применяемые для диагностики и эффективности лечения сифилиса

--------------------------------------- Глава 3 --------------------------------------------

же время тесты VDRL и RPR — взаимозаменяемые и оказываются недостаточными для выявления ранней первичной инфекции.

При подозрении на первичную инфекцию у беременной необхо­димо проводить определение FTA. Однако диагноз первичной инфекции в большинстве случаев можно поставить путем тщатель­ного клинического обследования, сбора анамнеза и темнопольной микроскопии материала, взятого из любых участков поражения. Тест FTA применяется также в качестве контрольного теста для подтверждения результатов, полученных при исследовании мате­риала каким-либо из скрининг-тестов.

Современные серологические методики непригодны для диагно­стики сифилиса у плода.

Имеющиеся у матери антилипидные и антитрепонемные анти­тела могут пассивно проходить через плаценту; следовательно, об­наружение антител в крови плода не обязательно подразумевает наличие инфекции. Поэтому, учитывая эффективность лечения ин­фекции у матери, следует ориентироваться именно на это лечение в сочетании с регулярными серологическими обследованиями ново­рожденного для подтверждения эффективности терапии.

Окончательный диагноз сифилиса у новорожденного может быть поставлен при выявлении возбудителя — обычно путем тем-нопольного микроскопического исследования материала, получен­ного из пораженных участков тела. Серологическая диагностика у младенцев проблематична, так как антилипидные и антитрепонем­ные антитела IgG-антитела, имеющиеся у матери, могут пассивно передаваться плоду через плаценту. Антитела, полученные от матери, могут персистировать у младенца в течение нескольких месяцев, но, как правило, исчезают к 6-месячному возрасту. Ново­рожденный может быть обследован на наличие IgM-антител. Мате­ринские IgM-антитела не проходят через плаценту, и позитивный результат в этом случае позволяет предположить врожденную ин­фекцию. Однако при этом могут наблюдаться как ложноположи-тельные, так и ложноотрицательные результаты, и младенцы с врожденной инфекцией могут не быть IgM-позитивными вплоть до 3-месячного возраста. Кроме того, инфицированные младенцы могут быть и серонегативными при рождении, если мать была инфи­цирована в третьем триместре беременности. Поэтому рекоменду­ется проводить повторный скрининг младенцев, подверженных риску инфекции, вплоть до 6-месячного возраста.

В постнеонатальном периоде и в раннем детском возрасте кли­нический диагноз врожденного сифилиса может быть подтвержден путем серологического обследования.

--------------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------------

Токсоплазмоз

Материалом для исследования у беременной женщины являет­ся сыворотка крови. Диагноз основывается на определении специ­фических антител. Наиболее достоверным подходом в этом случае является выявление специфической IgG-сероконверсии (т. е. пере­ход отрицательных результатов исследования в положительные). Точно установленная IgG-сероконверсия может быть подтвержде­на выявлением специфических IgM-антител. В этом случае стано­вится очевидным, что речь идет об острой инфекции, создающей риск внутриутробной передачи токсоплазмоза.

Если серологические тесты в первом триместре беременности указывают на наличие инфекции у матери, необходимо обследо­вать плод с помощью ультразвуковой эхографии и кордоцентеза. В крови плода, полученной путем кордоцентеза, можно измерить уровень IgM-антител

Принятым «эталонным» методом для количественной оценки антител против токсоплазм является тест окрашивания. Ввиду технической сложности и высокой его стоимости, выполняется только в специализированных центрах. Традиционные варианты метода ELISA при количественном определении IgM-антител часто дают ложноположительные результаты, связанные с избытком специфических IgG-антител, и ложнопозитивные реакции, связан­ные с присутствием ревматоидного и антинуклеарного фактора в сыворотке.

У новорожденных с выраженными поражениями предположи­тельный диагноз может быть поставлен на основании клинических данных. При выделении паразита из ткани плаценты диагноз врожденной инфекции становится весьма вероятным, но и отрица­тельные результаты исследования не исключают такого диагноза. Выделение Т.gondii из крови новорожденного имеет диагностичес­кое значение, но, как и при культивировании ткани плаценты, отрицательные результаты могут быть получены при наличии врожденной инфекции, особенно если проводилось пренатальное лечение. Для выделения паразитов из крови плода требуется ускоренная и высокочувствительная методика. Заражение живот­ных является высокочувствительным методом, однако оконча­тельные результаты могут быть получены только через 45 дней. Более быстрым методом является выращивание токсоплазм в куль­туре ткани, но при этом не обеспечивается достаточный уровень чувствительности. Эти проблемы можно преодолеть с помощью мо­лекулярной биологии в целях обнаружения специфической ДНК.

--------------------------------------- Глава 3 --------------------------------------------

Серологическое обследование младенца осложняется при нали­чии у ребенка (как инфицированного, так и неинфицированного) пассивно приобретенного материнского иммуноглобулина G. Титр материнских антител, выявленных у младенца после родов, про­грессивно снижается. Если не считать случаев обнаружения чрез­вычайно высоких исходных титров, то материнские антитела обычно исчезают из крови младенца к 10-месячному возрасту. На­личие специфических IgM-антител свидетельствует о врожденной инфекции, но лишь у 1/3 новорожденных с врожденной инфекци­ей вырабатываются IgM-антитела в определяемых уровнях. Накопленный до настоящего времени опыт свидетельствует о боль­шом значении определения IgA-антител для постнатальной диаг­ностики врожденного токсоплазмоза.

Ветряная оспа

Клинический диагноз ветряной оспы можно подтвердить серо­логическими методами путем обнаружения четырехкратного нарастания титров антител в парных сыворотках, взятых в опреде­ленные периоды, и выявления специфических IgM-антител к виру­су ветряной оспы. IgG и IgM-антитела появляются через 2-5 дней после возникновения сыпи, их уровни достигают пика через 3-5 дней, затем титры IgM-антител снижаются, и через несколько месяцев эти антитела уже не выявляются; IgG-антитела персисти-руют в течение всей жизни. Уровни антител можно достоверно оп­ределить с помощью реакции связывания комплемента (РСК), иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментными методика­ми (ИФА). Нарастание титров IgG-антител может быть у пациентов с первичными поражениями, вызванными вирусом простого герпе­са, а также у пациентов с опоясывающим лишаем.

Для подтверждения неонатальной инфекции используют опреде­ление специфических IgM-антител. У некоторых IgM-негативных больных ретроспективные доказательства врожденной инфекции были получены путем выявления персистенции специфических IgG-антител в течение первого года жизни. Сообщения об антена­тальной диагностике врожденной инфекции ветряной оспы путем выявления специфических IgM-антител в крови плода отсутствуют.

Лабораторное подтверждение ветряной оспы у взрослого или но­ворожденного можно осуществлять путем идентификации вируса ветряной оспы в жидкости везикул. Частицы вируса эффективно выявляются путем электронной микроскопии. Обнаружение спе­цифических антигенов в везикулярной жидкости методом мечен-

---------- —------------------------ Глава 3 --------------------------------------------

ных флюоресцином антител осуществляется гораздо быстрее. Попытки выделить вирус у младенцев с синдромом врожденной ветряной оспы обычно оказываются безуспешными.

ВИЧ

С 1984 года основой диагностики ВИЧ-инфекции являются им­мунологические методы.

Специфический диагноз можно поставить путем тестирования крови на наличие антител против ВИЧ (анти-ВИЧ). У большинства пациентов сероконверсия отмечается в течение 6-8 недель после инфицирования, хотя в некоторых случаях антитела выявляются только через 6-9 месяцев. Поэтому отрицательный тест на наличие антител может считаться достоверным, если пациент не имел экс­позиции к вирусу в течение приблизительно 6 месяцев. При нали­чии постоянного риска инфекции отрицательный тест не имеет существенного значения.

Иммуноферментный анализ является первым скрининговым этапом обследования. Он позволяет определить в сыворотке крови суммарные антитела к ВИЧ. Если в ELISA получен положитель­ный результат, проводят два повторных исследования данного образца тем же методом; при двух отрицательных результатах по­вторных исследований кровь считается неинфицированной. Если одно или оба исследования повторяют ранее полученный резуль­тат, его перепроверяют на втором этапе — стадии подтверждающей диагностики. На этом этапе осуществляется исследование сыворот­ки крови с помощью метода иммуноблотинга, позволяющего уста­новить наличие антител к отдельным протеинам ВИЧ.

Выявление в сыворотке антител к поверхностным протеинам ВИЧ (gpl60, gpl20, gp41), как правило, обнаруживающихся в со­четании с антителами к ядерному белку р24, свидетельствует о на­личии ВИЧ-инфекции. Положительными считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2-3 гликопротеидам ВИЧ.

Среди антигенов ВИЧ наиболее часто определяют белок р24, Антиген р24 не связан с антителами только в начальный период за­болевания и в стадии СПИДа, поэтому он может быть использован для диагностики ВИЧ только в эти периоды. Высокой специфично­стью обладает метод ДНК-зондов, или молекулярной гибридизации, или полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод позволяет оп­ределять генетический материал вируса даже в начальный период

--------------------------------------- Глава 3 -------------------------------------------

болезни. Кроме того, ПЦР выявляет количество РНК-копий виру­са в 1 мл крови («вирусная нагрузка»), что является одним из ос­новных лабораторных маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции.

Теоретически решающим для уточнения вопроса об инфициро-ванности организма ВИЧ является выделение культуры вируса. Од­нако на практике возможности применения этого метода ограниче­ны из-за дороговизны исследования, низкого количества копий вируса в крови больных в некоторые периоды заболевания, что де­лает невозможным выделение вируса, и длительность получения ре­зультата. Таким образом, хотя выделение культуры ВИЧ является важным диагностическим тестом, но он практически не применя­ется из-за большой трудоемкости исследования, необходимости специально оборудованной лаборатории, высокой стоимости, дли­тельности получения результата (2-4 недели).

Для определения глубины иммуносупрессии и прогнозирования развития тех или иных вторичных заболеваний применяют опреде­ление уровня CD4+T-лимфоцитов. У здоровых взрослых людей ми­нимальное количество СD4+Т-лимфоцитов составляет 1400 в 1 мкл. При ВИЧ-инфекции количество этих клеток снижается до 500 в 1 мкл. В стадии СПИДа их менее 200 в 1 мкл.

В настоящее время нет никаких данных об эффективной диаг­ностике инфекции у плода. Результаты проводимых тестов трудно интерпретировать, и даже самый чувствительный из них — ПЦР — не может считаться достоверным на самых ранних этапах жизни. Обнаружение антител против вируса как традиционный подход достаточно трудно применять для диагностики внутрима-точной и/или неонатальной инфекции. Эти трудности связаны с наличием материнских антител, перенесенных через плаценту. Поэтому необходимо регулярно обследовать ребенка, чтобы вы­явить исчезновение или постоянное наличие антител. На практике это означает, что последующее наблюдение должно продолжаться не менее 15-18 месяцев.