Введение мочевины и b-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты

Высокая концентрация белков в зонах может привести к их
осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: ди-
мерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, ко-
торые могут давать дополнительные полосы. Агрегация проис-
ходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвра-
щения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концент-
рации 4 — 8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности
деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возмож-
ность частичного разложения мочевины с образованием циано-
вой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно отно-
сится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять
сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением
геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появи-
лась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исход-
ный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозритель-
ная полоса. Для предварительной деионизации маточный рас-
твор мочевины (10 М) суспендируют с бифункциональной ионо-
обменной смолой (например, AG 501 ´ 8) в соотношении 5 г
смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной темпе-
ратуре.

b-Меркаптоэтанол в концентрации 1 — 5% нередко вносят в
исходный белковый препарат для предохранения его от окисле-
ния и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энер-
гичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей
и разделением белковых субъединиц производят путем нагрева-
ния белкового раствора до 90 — 100° в присутствии не только b-
меркаптоэтанола или его аналогов, но н ДДС-Na.

В некоторых случаях при использовании боратного буфера
или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), воз-
можно образование комплексов компонентов буфера с белками.
Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколь-
ко иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые по-
лосы раздвоятся. Проверить такого рода артефакт можно по-
вторным электрофорезом. В силу равновесного характера про-
цесса образования комплексов каждая из двух полос дублета
при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две
полосы.

В главе 1 уже упоминалось об опасности, которую представ-
ляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации
долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на спо-
соб их удаления — «преэлектрофорез», т. е. пропускание тока
через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых слу-
чаях для полной очистки от радикалов во время преэлектрофо-
реза через гель пропускают такие связывающие их соединения,
как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или
гидрохинон.

При фракционировании очень малых количеств белка может
оказаться заметной сорбция их на геле (белки «размазывают-
ся» по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исход-
ный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Про-
ходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он
насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.