Загрузка геля. Ширина белковых зон

Очевидно, что разделение близко идущих зон белков будет
тем успешнее, чем уже сами эти зоны, поэтому при электрофо-
резе следует заботиться о максимальном сужении белковых зон
(полос). Это накладывает ограничения на допустимую загрузку
геля. Разумеется, строгость таких ограничений зависит от со-
става белковой смеси и характера разделения полос. В качестве
ориентировочного максимума можно принять загрузку порядка
1 мг суммарного препарата белка на 1 см² сечения геля. Для
кармана шириной 5 мм в пластине толщиной 1,5 мм это соответ-
ствует примерно 75 мкг белка, а для трубки диаметром 6 мм —
до 200 мкг. Идентификацию полос белка по их окраске можно
проводить при загрузках, в 10 раз меньших. При перегрузке бел-
ковые полосы бывают резкими в передней своей части и размы-
тыми сзади. При этом следует всегда считаться с возможностью
преципитации белка в момент вступления его в гель, когда все
макромолекулы стягиваются в узкую полоску и локальная кон-
центрация их сильно увеличивается.

Чем меньше загрузка геля, тем лучше разделение близких
зон. Ограничения в этом случае накладываются только метода-
ми обнаружения слабых полос. Поскольку диффузия зон идет
во времени, всегда желательно сокращение продолжительности
электрофореза, но не за счет чрезмерно высокой силы тока, вы-
зывающей неравномерный нагрев геля и искажение полос.
Электрофорез при пониженной температуре в этом плане дает
немного. Интенсивность диффузии уменьшается, но вместе с тем
снижается и электрофоретическая подвижность белков, а следо-
вательно, увеличивается продолжительность электрофореза.

В простом варианте электрофореза желательно наносить бел-
ковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота ис-
ходного слоя препарата была не более 2 — 3 мм. Выполнить это
условие нередко бывает затруднительно ввиду недостаточной
концентрации исходного препарата. На основании приведенных
выше цифр легко рассчитать, что концентрация белка в препа-
рате должна составлять 3 — 5 мг/мл. Ряд мер позволяет обойти
эту трудность; они направлены на концентрирование белкового
препарата в узкую зону в момент вступления его в рабочий гель.
Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем
область с повышенной напряженностью поля, где белки мигри-
руют намного быстрее, чем в рабочем геле. В момент перехода
из этой области в рабочий гель они будут стягиваться в узкую
полосу, так как находившиеся первоначально далеко позади

Рис. 16. Концентрирующий эффект электрофореза в градиентном геле (4 —
30% ПААГ)

а — начало фракционирования белков сыворотки; б — тот же гель после 60 ч диффузии
при комнатной температуре и выключенном напряжении; в — через 6 ч после возобновле-
ния электрофореза

молекулы белка «догонят» впереди идущие молекулы, замедлив-
шие свое движение при вступлении в рабочий гель.

Область с повышенной напряженностью поля можно создать
в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малопод-
вижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход исполь-
зован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного
ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного
препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5 — 10 раз ме-
нее концентрированном (вариант 1). Нанесение препаратана
гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое примене-
ние в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого
приема.

Другой очень эффективный способ сужения полос — исполь-
зование градиента пористого геля. В этом случае при миграции
вдоль геля передний край каждой полосы все время оказывает-
ся в области чуть более концентрированного геля, чем задний.
Молекулы белка, расположенные ближе к переднему краю по-
лосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что
и приводит к непрерывному сужению полос в ходе их продви-
жения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстри-
ровали специалисты фирмы «Рharmaciа» на выпускаемых этой
фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации
ПААГ (4 — 30%). Начав электрофоретическое фракционирова-
ние белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли
пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время диф-
фузия полностью размывала сформировавшиеся было белковые
полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза
удавалось получить четкую картину полос, содержащуювсе
обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16).