Миграция белков в геле

Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность
биополимеров в геле (и') пропорциональна их подвижности в
свободной жидкости (u_о), которая определяется отношением
суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, об-
условливающим отличие и' от u_о является сила трения о гель,
которая зависит от соотношения линейных размеров макромо-
лекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс бел-
ков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляюще-
го большинства индивидуальных белков не превышают 500 000.
Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесооб-
разным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести
только по величине отношения заряда к массе. Как правило,

электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5 — 20%
акриламида.

Белки являются, цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а
следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять

путем изменения рН буфера, в котором полимеризуют ПААГ и
ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим.
Очевидно, что оптимальное значение рН рабочего буфера обус-
ловливает не максимальный заряд, а максимальное различие
зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэто-
му в большинстве случаев нецелесообразно использовать экст-
ремальные величины рН рабочего буфера, слишком удаленные
от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных
кислых белков оптимальные значения рН буфера оказываются
в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков
идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков
(гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать
слабокислые буферы (рН 4 — 5). Эти белки различаются по ве-
личине суммарного положительного заряда и мигрируют в на-
правлении от анода к катоду.

Несмотря на малое количество фракционируемого белка,от
рабочего буфера требуется существенная емкость, так как при
образовании зоны локальная концентрация белка может ока-
заться значительной. Поэтому приходится использовать буферы
с концентрацией 0,1 — 0,2 М и более. При этом следует учиты-
вать, насколько близко к границе буферной области лежит рабо-
чее значение рН. Если такое приближение к границе необходи-
мо, то для обеспечения достаточной буферной емкости моляр-
ность буфера приходится еще увеличивать. Вопрос об электро-
проводности буферов рассмотрен ниже.

Отметим далее, что эффект трения о гель зависит не только
от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости бел-
ковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агре-
гации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или
менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упа-
ковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные
белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем
самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эф-
фект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеи-
новых кислот.

Для однозначного определения молекулярной массы белка
по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесооб-
разно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей
жесткость. Именно такой прием используется при электрофоре-
зе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно
это будет рассмотрено ниже).

Напряженность электрического поля (Н)

Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на
весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка
геля длиной l Е = Нl. В проводящей ток жидкости приложен-
ному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока I, ко-
торая в соответствии с законом Ома определяется суммарным

сопротивлением цепиR (I=E/R). В ПААГ проводящей жидко-
стью служит буфер, находящийся между нитями полимера.
Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заря-
женные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим
вкладом можно пренебрегать.

Электрическое сопротивление буфера определяется двумя
факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электро-
форетической подвижностью. Второй фактор играет очень важ-
ную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух бу-
ферах ионов С1^– и СН₃СОО^– электропроводность первого буфе-
ра будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о
том, что электрический ток одинаков по всей длине электриче-
ской цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разры-
вов или скачков тока по длине геля физически быть не может,
это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряжен-
ностью электрического поля.

Если в любой электрической цепи последовательно включе-
ны два различных по своей величине сопротивления R₁ и R₂, то
одинаковый для всей цепи ток I протекает через первое из них
за счет падения на нем напряжения Е₁=IR₁, а через второе — за
счет Е₂=IR₂. Полное напряжение по всей электрической цепи
Е=Е₁+Е₂. Если R₁ сильно отличается от R₂, то и Е₁ также от-
личается от E₂. При изменении сопротивлений двух участков рас-
пределение напряжений на них может существенно измениться,
оставаясь в сумме своей неизменным.

Такая ситуация может возникать в ПААГ, состоящем из двух
последовательно расположенных участков, где при полимериза-
ции были использованы разные буферы (содержащие ионы с
разной подвижностью или просто различающиеся по концентра-
ции). Сопротивления этих участков могут оказаться разными:
следовательно, различными могут быть и падения напряжения
на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако
заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значе-
ния напряженности поля на двух участках. Действительно, па-
дение напряжения на участке пропорционально его сопротив-
лению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля
есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому
соотношение напряженностей поля на двух участках геля не за-
висит от их длины и определяется только концентрациями и под-
вижностями содержащихся в них ионов. Это — очень важный
вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию
можно себе представить в двух простейших вариантах.

Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно,
ионы на двух участках геля (A и В) одинаковы, но концентра-
ция буфера на участке A в 10 раз меньше. Это приведет к тому,
что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В.
Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля,
и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем
такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их

концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое се-
чение обоих участков, а также через границу между ними, будет
одинаковым, что и означает неизменность тока I по всей длине
составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что
количество ионов в A не истощается — оно пополняется за счет
ионов, поступающих из электродного буфера.

Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обо-
их участках одинаковы, но ионы на участке A отличаются на-
много меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет
о подвижности в свободной жидкости (u₀), так как сетка геля
не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле
A содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном рH),
а в геле В — ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обуслов-
ливает большую величину сопротивления. Суммарное напряже-
ние распределится между участками A и B так, что напряжен-
ность поля в A будет соответственно выше, причем именно на-
столько, чтобы скорость миграции ионов глицина, пропорцио-
нальная произведению подвижности на напряженность поля,
стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует
условие неизменности величины тока вдоль всего геля.

В более сложных случаях могут различаться как подвижно-
сти ионов, так и их концентрации, но в любом случае напряжен-
ности электрического поля в двух последовательно расположен-
ных участках геля устанавливаются такими, что они компенси-
руют все различия и обеспечивают постоянство тока во всем
геле. Значения напряженности могут при этом оказаться очень
разными. Очень важно, что это различие существенным образом
влияет и на соотношение скоростей миграции одних и тех же
белков (или нуклеиновых кислот) в двух участках геля. На "ом
участке, где напряженность поля выше, белки будут двигаться
быстрее, чем на соседнем. Эта любопытная ситуация будет рас-
смотрена ниже при обсуждении проблемы сужения белкоых
зон для противодействия диффузии. В заключение заметим, что
сам процесс электрофореза в рабочем геле следует вести в од-
нородном по напряженности электрическом поле, чтобы разде-
ление белков отражало истинное различие их собственных ха-
рактеристик — молекулярных масс и электрического заряда.