Выбор буфера рабочего геля

Вернемся к зависимости тока и напряженности поля в геле от
природы и концентрации рабочего буфера. Заметим сразу, что
сама по себе величина рН практически не сказывается на элект-
ропроводности геля. Даже при рН 4 концентрации протонов
(0,1 мМ) не даст заметного вклада в электропроводность по
сравнению с ионами буфера, концентрация которых, как будет
видно дальше, как минимум в 100 раз выше. То же относится и
к ионам ОН^– в реально используемом диапазоне рН щелочных
буферов.

В то же время косвенным образом выбор рН может сильно
влиять на электропроводность данного буфера, определяя сте-
пень диссоциации его ионов. Рассмотрим широко используемый
Трис-НСl-буфер. В нем всегда находятся ионы Трис⁺, С1^– и не-
заряженные молекулы Триса. Для этого буфера рK_a= 8,1. Это
означает, что при рН 8,1 ровно половина молекул Триса несет
положительный заряд, практически целиком за счет протонов
соляной кислоты, которой титровали буфер. Очевидно, что в рас-
творе находится такое же количество ионов С1^–. Таким образом,
при рН 8,1 0,1 М Трис-НСl содержит 0,05 М Трис⁺ и 0,05 М С1^–.
Электропроводность этого буфера будет определяться, в основ-
ном, ионами С1^–, так как их подвижность намного выше, чем у
тяжелых ионов Трис⁺. 0,05 М С1^– обеспечивает достаточно вы-
сокую электропроводность. Трис-ацетатный буфер такой же
концентрации и рН имеет значительно меньшую электропровод-
ность, так как подвижность аниона СН₃СОО^– явно ниже, чем
С1^–.

При рН 6,7 электропроводность 0,1 М Трис-НСl увеличится
примерно вдвое, так как этот рН лежит вблизи границы буфер-
ной емкости Триса и почти все его молекулы будут ионизирова-
ны; следовательно, концентрация С1^– составит около 0,1 М. На-
оборот, при рН 8,9 электропроводность этого буфера значитель-
но ниже, чем при рН 8,1, так как для титрования до рН 8,9 по-
требуется заметно меньше НС1.

Существенную роль в определении электропроводности иг-
рает выбор природы буфера, т. е. характера его ионов. Легко
понять, что К- или Nа-фосфатные буферы, как и Трис-НСl, от-
личаются высокой электропроводностью за счет ионов К⁺ и
Nа⁺. То же относится к К- или Nа-ацетатным буферам. Между
тем электрофорез в чистой уксусной кислоте умеренной концент-
рации не связан с высокой электропроводностью. Имидазол-фос-
фатный буфер той же молярности, что и К-фосфатный, отлича-
ется меньшей электропроводностью. Относительно низкую
электропроводность имеют Трис-боратный, Трис-глициновый и
Трис-барбитуратный буферы. Вообще, можно утверждать, что
электропроводности буферных систем, в которых не участвуют
легкоподвижные ионы сильных неорганических кислот и щело-
чей, относительно невелики. Это важное заключение будет иг-
рать существенную роль в дальнейшем изложении. К сожале-
нию, такие буферы нередко отличаются и меньшей емкостью.

Таким образом, электропроводность рабочего буфера опре-
деляется тремя факторами: концентрацией, необходимой для
поддержания нужного рН в белковых зонах, степенью диссоциа-
ции буферных веществ при этом рН и характером участвующих
в диссоциации ионов.

Очевидно, что буфер геля не должен содержать посторонних
солей даже в малых концентрациях. Соль, зачастую присутству-
ющую в исходном препарате, несмотря на его малый объем, сле-
дует предварительно удалить или хотя бы снизить ее концентра-

цию до 0,05 М. На избыток соли в препарате указывает, между
прочим, размытый характер передней границы и резкая задняя
граница полосы препарата сразу после его вступления в гель.
При нормальном разделении должна иметь место как раз об-
ратная картина — резкая передняя и более диффузная задняя
граница полосы. Это можно проконтролировать путем окраши-
вания пробного геля через 20 — 30 мин после начала электрофо-
реза или при использовании люминесцентных маркеров (см.
ниже).

Помимо суммарной электропроводности, определенную роль
играет электрофоретическая подвижность ионов буфера, мигри-
рующих в том же направлении, что и разделяемые макромоле-
кулы. Качество полос выигрывает, если эти ионы по своей под-
вижности приближаются к самим макромолекулам. Таковы
большие органические ионы: Трис⁺ (катион), остатки барбиту-
ровой и какодиловой кислот (анионы) и такие цвиттерионы, как
глицин и аланин. Следовательно, при прочих равных условиях
Трисовый буфер следует предпочесть при фракционировании ще-
лочных белков, а барбитуратный — для кислых белков вблизи
нейтральной области рН буфера.