Выбор рабочего буфера

Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности
и сохранения вместе с тем ощутимых различий в суммарных
электрических зарядах белков выбирают рН буфера, отличаю-
щийся на 3 — 4 единицы от среднего значения рI для белков дан-
ного типа. Если эти значения неизвестны, то желательно соста-
вить себе представление о характере зарядов белков при раз-
личных рН по характеру их сорбции на ионообменных смолах.

Для кислых белков часто используют буфер с рН 8,9, для
щелочных — с рН 4,3 — 4,5. В качестве слабощелочных буферов

для кислых белков применяют Трис-HCl, Трис-глициновый,
Трис-боратный или Трис-барбитуратный. Для щелочных белков
чаще всего используют К-ацетатный и Трис-ацетатный буферы,
а иногда, если белок это выдерживает, то и просто уксусную
кислоту в концентрации 0,9 М или 5% (0,9 М СН₃СООН имеет
рН 2,4; 0,1 М — рН 2,87). О преимуществах буферов, не содер-
жащих легко подвижных ионов (С1^–, К⁺), было сказано выше.

Концентрацию буфера выбирают, исходя из допустимой мощ-
ности тепловыделения, и вместе с тем так, чтобы напряженность
электрического поля в геле не превышала 15 В/см. При более
высоких значениях напряженности возможны искажения формы
белковых полос. Для 0,1 М Трис-глицинового буфера, напри-
мер, такой напряженности отвечает плотность тока 20 мА/см².
Это означает, что через трубку диаметром 6 мм и длиной 8 см
в этом случае можно пропускать ток до 5,5 мА при напряжении
120 В. Поскольку трубки довольно трудно охлаждать, обычно
используют меньшие величины тока — около 3 мА на трубку.
Для вертикальной пластины размером 10 ´ 14 см и толщиной
1,5 мм в этих же условиях сила тока составит около 30 мА при
напряжении около 210 В. Разумеется, эти цифры приведены
лишь для ориентировки, и для других условий электрофореза
они окажутся иными. Впрочем, вариации для хорошо выбран-
ных систем оказываются не очень значительными, так как для
любой буферной системы сохраняется одна и та же тенденция —
использовать максимально возможную напряженность поля при
максимально допустимой с точки зрения теплоотвода мощности
тока.

В двух приведенных простейших примерах напряженность
поля в геле можно рассчитывать просто путем деления напря-
жения, указываемого источником тока, на длину геля. При этом
пренебрегают падением напряжения в электродных резервуа-
рах — на участке цепи между электродами и гелем. В том слу-
чае, когда электродные буферы находятся в непосредственном
контакте с гелем, это вполне допустимо.

Иначе обстоит дело в приборах с горизонтально расположен-
ными пластинами. Например, для электрофореза в приборе типа
«Мультифор» при ширине пластины 20 см и толщине геля 1 мм
плотности тока 20 мА/см² соответствует его сила 40 мА. Паде-
ние напряжения в самом геле длиной 10 см при напряженности
поля 15 В/см составит, очевидно, 150 В. Однако напряжение, ко-
торое надо установить на источнике тока, должно быть сущест-
венно выше ввиду значительного падения напряжения на фити-
лях, соединяющих буферные резервуары с гелем. Это падение
напряжения трудно оценить, поэтому для выяснения значения
напряженности поля в самом геле прибор «Мультифор» снабжен
специальным вольтметром, измеряющим падение напряжения
между двумя точками поверхности геля, находящимися на опре-
деленном расстоянии друг от друга. В рассмотренном примере
использовали Трис-глициновый буфер с довольно высоким элект-

рическим сопротивлением. Мощность, расходуемая в приборе
«Мультифор», в этом случае составит всего лишь 6 Вт (150 В ´
´ 0,04 А). Иная картина получится, если тот же гель заполиме-
ризовать в 0,1 М Na-фосфатном буфере с рН 7,1. Электропровод-
ность этого буфера довольно высока за счет легко подвижных ио-
нов Na⁺. Измерения в том же приборе показывают, что уже при
напряженности поля 5 В/см (падение напряжения — 50 В на
пластину) плотность тока в геле возрастает до 100 мА/см². Если
довести напряженность поля в геле до 15 В/см, то сила
тока через пластину сечением 2 см² (20 ´ 0,1 см) составит
600 мА. При падении напряжения на геле, равном 150 В, это
привело бы к совершенно неприемлемому уровню тепловыделе-
ния (мощность 90 Вт). Однако дойти до этого режима практи-
чески невозможно ввиду большого падения напряжения на фи-
тилях, их разогрева, обсыхания и дальнейшего увеличения со-
противления. В итоге, при работе с фосфатным буфером прихо-
дится ограничивать силу тока (~200 мА) и работать при пони-
женных значениях напряженности электрического поля. Соот-
ветственно увеличивается и продолжительность электрофореза.

Еще раз подчеркнем, что электропроводность любого буфера
определяется не только концентрацией, но степенью и характе-
ром его ионизации (близостью рН к рK_a буфера и подвижностью
образующих ионов). Концентрации рабочих буферов в пределах
0,05 — 0,1 М можно считать ориентировочно нормальными, хотя
для слабо ионизированных буферов, используемых вблизи гра-
ницы их буферной области, можно встретить в литературе и бо-
лее высокие значения концентрации — вплоть до 0,4 М.

В непрерывной системе сопротивление геля не должно замет-
ным образом изменяться в процессе электрофореза. Как след-
ствие этого, не должна изменяться и расходуемая мощность. По-
вышение напряжения источника, работающего в режиме посто-
янного тока, или уменьшение силы тока при постоянном напря-
жении говорят о каких-то неполадках в электрической цепи, на-
пример: о высыхании фитилей или нарушении контактов между
ними и гелем.