Фракционирование гистонов и других щелочных белков.

5%-ный (0,9 М) раствор уксусной кислоты с добавлением 4 —
8 М мочевины часто используют для электрофоретического
фракционирования гистонов [Panyim, Chalkley, 1969]. Молеку-
лярные массы гистонов лежат в диапазоне 11 — 22 тыс. дальтон,
поэтому для их разделения используют мелкопористые гели
(T = 15 — 20). Положительно заряженные в кислой среде гисто-
ны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью
обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в
этой простой системе разделяются довольно плохо. От них за-
метно отстает относительно более крупный гистон H1. В каче-
стве лидирующего красителя используют пиронин.

Недавно Спайкер описал систему фракционирования гисто-
нов в двуступенчатом ПААГ с «кислой мочевиной». Основной
рабочий гель — пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в
0,9 М СН₃СООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована
полоска формирующего геля: 7,5% ПААГ в 0,375 М СН₃СООК,
рН 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напря-
жении — за 1 — 2 ч. Качество полос и их разрешение в такой си-
стеме сильно выигрывают [Spiker, 1980].

Электрофорез «в кислой мочевине» успешно используют и
для фракционирования других щелочных белков: рибосомных,
факторов инициации трансляции, субъединиц РНК-полимеразы
и др. Впрочем, намного более совершенное разделение сложных
смесей этих белков происходит при двумерном электрофорезе,
когда фракционирование «в кислой мочевине» используют в од-
ном из направлений. Ниже, при анализе метода двумерного
электрофореза, будут даны соответствующие ссылки.

Если есть опасение, что воздействие уксусной кислоты на бе-
лок может оказаться слишком жестким, то ее 50%-ный раствор
титруют КОН до рН 4,3 — 4,5. При этом надо иметь в виду, что
электропроводность такого буфера будет за счет ионов калия
значительно выше, чем одной уксусной кислоты, что потребует
соответствующего уменьшения напряжения, подаваемогона
гель.

Описано электрофоретическое разделение гистонов и при
рН 7,8 (0,18 М глицилглицин, титрованный NaOH), которое ис-
пользуется для изучения гистон-гистонового взаимодействия и
некоторых лабильных модификаций гистонов. Все гистоны, кро-
ме H1, при этом почти одинаково и относительно слабо заряже-
ны, поэтому фракционирование идет главным образом по моле-
кулярной массе. Добавление мочевины предупреждает агрега-
цию гистонов, однако несколько изменяет взаимное расположе-
ние полос. Мочевина разворачивает гистоны Н2А, Н2В и Н3,
но не влияет на конфигурацию H1 и Н4. По-видимому, эти по-

следние развернуты и в отсутствие мочевины [Hoffman, Chalk-
ley, 1976].

Щелочные белки рибосом удается разделять не только в кис-
лых, но и в слегка щелочных условиях, например в Трис-борат-
ном буфере, рН 8,7. Электрофорез проводят в 4%-ном ПААГ
[Howard, Traut, 1973]. Исходный белковый препарат полимери-
зуют в геле с мочевиной на середине высоты трубки. Вблизи изо-
электрической точки часть рибосомальных белков оказывается
заряженной отрицательно, а другая — положительно. Миграция
в электрическом поле идет в обе стороны, к катоду и аноду. Ще-
лочные белки рибосом при рН 8,7 растворяются с трудом и толь-
ко в присутствии 6 М мочевины, которую вводят также и в бу-
фер геля.

Электрофорез хроматина. Электрофоретическое фракциони-
рование хроматина после его обработки микрококковой нуклеа-
зой ведут в буфере низкой ионной силы, например в 0,01 М три-
этиламмоний-НСl (рН 7,6; 2 мМ ЭДТА), что обусловлено плохой
растворимостью хроматина в более концентрированных буферах.
Хроматин в целом (благодаря ДНК) заряжен отрицательно и
мигрирует к аноду. Удается разделить субнуклеосомы, моно-
нуклеосомы с различным содержанием ДНК и белков, лежащих
вне их «ядра» («core»), а также ди- и тринуклеосомы. Ввиду
малой электропроводности разбавленного буфера при напря-
женности 15 В/см сила тока через трубку диаметром 6 мм со-
ставляет всего лишь 3 мА. Электрофорез в трубках длиной 7 см
занимает 1,5 ч.