Использование мочевины

Уже указывалось, что для предотвращения агрегации белков
в рабочий буфер геля нередко вводят мочевину в концентрации
от 2 до 8 М. Ее, разумеется, добавляют и в исходный белковый
препарат. В электродные буферы вносить мочевину не нужно,
так как, не будучи заряженной, она не мигрирует в геле, а сле-
довательно, и не нуждается в пополнении. На электропроводно-
сти буфера присутствие мочевины практически не сказывается.
Однако под влиянием нового окружения могут изменяться рК
отдельных групп и суммарный заряд белка. Это может заметно
повлиять на конфигурацию, а следовательно, и на подвижность
белков.

В концентрированных растворах мочевины происходит дена-
турация белков, часть дисульфидных мостиков рвется и полипеп-
тидная цепочка, утратив вторичную структуру, ведет себя как
хаотический клубок. Денатурация не является полной и может
быть обращена. Степень и обратимость денатурации зависят от
природы белка и концентрации мочевины, поэтому при выборе
этой концентрации иногда приходится искать компромисс меж-
ду опасностью агрегации белков и угрозой их необратимой де-
натурации. Об очистке мочевины было сказано выше; добавим
только, что образование цианата в растворах мочевины идет ус-
коренно при щелочных рН, поэтому щелочные буферы с добав-
кой мочевины следует использовать сразу после их приготовле-
ния.

Для составления геля пользуются обычно «маточными» рас-
творами повышенной концентрации. Удобно, например, приго-
товить 40%-ный водный раствор смеси мономеров (T = 40). Ha-
помним, что Т выражает процентное отношение массы обоих мо-
номеров к конечному объему их раствора, а С — отношение мас-
сы NN^/-мeтилeнбиcaкpилaмидa к сумме масс двух мономеров.
Отсюда следует, что С не изменяется при разбавлении маточ-
ного раствора. Так, если предполагается иметь для рабочего
геля параметры Т = 10 и С = 2,6, то при составлении маточного
раствора можно взять T = 40 и С = 2,6. Практически это означа-
ет, что надо отвесить (40 ´ 2,6)/100 = 1,04 г метиленбисакрилами-
да и 40 — 1,04 = 38,96 г акриламида и растворить их в воде до ко-
нечного объема 100 мл. Маточный раствор буфера может иметь
двух- или пятикратную концентрацию. В последнем случае по-
лезно проверить, что рН буфера сохраняется при соответствую-
щем разбавлении. Смесь расчетных объемов маточных раство-
ров мономеров и буфера доводят до нужного объема водой.

Персульфат аммония лучше добавлять в минимальном объ-
еме, который можно не учитывать. Для этого готовят концент-
рированный, обычно 10%-ный, маточный раствор персульфата,
остатки которого вскоре приходится выбрасывать, так как он
не хранится. Объемом вносимого в смесь ТЕМЕД также всегда
можно пренебрегать. Выбор содержания персульфата аммония
и ТЕМЕД, порядок их внесения в раствор мономеров, необхо-
димость деаэрации и контроль за процессом полимеризации геля
были подробно рассмотрены в главе 1,

Для приготовления геля с высоким содержанием мочевины ее
добавляют во все маточные растворы. При растворении моно-
меров до Т = 40 концентрацию мочевины приходится ограничи-
вать значением 2 — 3 М. Зато маточный раствор буфера можно
приготовить на 10 М мочевине и такой же концентрации раствор
ее использовать для доведения до расчетного объема вместо
воды.

Особо гидрофобные белки, например тяжелые цепи миозина,
при концентрировании их в полосах агрегируют даже в присут-
ствии 8 М мочевины. Во избежание этого их можно обработать

фенолом, который играет роль мягкого детергента. Белок сна-
чала растворяют в буфере до безопасной концентрации, а потом
переводят в смесь, состоящую из 50% фенола, 25% уксусной
кислоты, мочевины до концентрации 2 М и воды. Электрофорез
проводят в ПААГ, полимеризованном в 35%-ной уксусной кис-
лоте с 5 М мочевины [d'Abbis et al., 1979].

В некоторых случаях бывает необходимо при электрофорезе
сохранить ферментативную активность белка — либо для по-
следующей его элюции и использования, либо для обнаружения
с помощью биологического теста, т. е. по превращению субстра-
та ферментативной реакции (см. ниже). Использование в этом
случае концентрированного раствора мочевины является неже-
лательным, и уменьшать опасность агрегации приходится за счет
снижения загрузки геля. Чувствительность биологических тестов
зачастую позволяет это сделать. Необходимо точно проверить
устойчивость фермента при выбранной величине рН рабочего
буфера. При этом следует иметь в виду, что истинная величина
рН в геле примерно на 0,5 ед. больше, чем у используемого ще-
лочного буфера, и на 0,5 меньше, чем у кислого [Shuster, 1971].

Иногда следует проверить сохранность ферментативной ак-
тивности белка в ходе электрофореза в связи с возможностью
разобщения фермента с другими белками или необходимыми
для его работы кофакторами. Такую проверку можно проводить
следующим образом: на разных стадиях электрофореза выре-
зать и гомогенизировать участки геля, содержащие соответству-
ющую белковую полосу, и прямо в гомогенате, в сопоставимых
условиях, проверять сохранение активности фермента, исполь-
зуя возможность диффузии субстрата реакции в гель, а ее про-
дукта — из геля.

Загрузка геля и подготовка препарата

Исходный белковый препарат растворяют в том же рабочем
буфере, но меньшей концентрации (в 5 — 10 раз). По рассмот-
ренным выше причинам это приводит к значительному сужению
исходной зоны белков при ее вступлении в гель. Если электро-
форез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в раз-
бавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфе-
ре геля. Еще раз подчеркнем необходимость удаления солей из
препарата; в противном случае эффект концентрирования белка
при вступлении в гель будет смазан. Недавно был предложен
простой и остроумный способ диализа белкового раствора в кап-
ле на плавающем мембранном фильтре [Marusyk, Sergeant,
1980].

Иногда проводят предварительное полное восстановление
белка путем прединкубации его в течение ночи при комнатной
температуре в буфере с рН 8,5 — 9, содержащем 0,1 М (b-меркап-
тоэтанола и 9 М мочевины (щелочное значение рН буфера спо-
собствует восстановительному эффекту b-меркаптоэтанола).

В раствор препарата добавляют до 10% глицерина или саха-
розы, чтобы облегчить его подслаивание под электродный буфер
(см. выше). Наконец, в препарат вносят еще и краситель, на-
пример бромфеноловый синий до концентрации 0,01%. Мигра-
ция этой «лидирующей» зоны до конца геля определяет момент
окончания электрофореза. Заметим кстати, что при последую-
щей фиксации белков бромфеноловый синий обесцвечивается.
Если далее предполагается определение величины R_f, то поло-
жение окрашенной полоски сразу после извлечения геля из фор-
мы следует отметить (например, вколоть в гель тонкую прово-
лочку) .

Как уже подчеркивалось, препарат должен быть заведомо
свободен от пыли, нерастворенных белков и других частиц. Пос-
ле внесения препарата в трубку или карман пластины на 5 —
15 мин включают напряжение, пониженное примерно вдвое про-
тив расчетного. За это время лидирующий краситель должен
полностью войти в гель. Такая процедура улучшает условия
формирования исходной белковой полосы в геле. Затем перехо-
дят на расчетный режим электрофореза по напряжению и силе
тока.

Вопросы фиксации, окраски и других методов обработки бел-
ков после электрореза,как и способы определения радиоактив-
ности и элюции белков, рассмотрены отдельно ниже.