Селекція сигналів в методі HMQC за допомогою імпульсу BIRD

Не кожний спектрометр ЯМР або датчик укомплектований обладнанням для імпульсних градієнтів і тому пристосований для проведення описаних вище експериментів з гетероядерної кореляції. Коли неможливо використовувати градієнтну селекцію, цілком придатною виявляється альтернативна схема видалення небажаних сигналів і одержання спектрів без значних артефактів. У варіанті BIRD (Bilinear rotation decoupling) (Рис.6.41), небажані сигнали ¹Н-¹²С придушуються перед використанням послідовності HMQC за допомогою дотепної схеми насичення. Вона полягає в інверсії сигналу протонів, що пов'язані з ¹²С, за допомогою так званого імпульсу BIRD (вплив цього імпульсу описаний нижче). Сигнал протонів, пов'язаних з ¹³С при цьому залишається незмінним. Наступний за інверсією період відновлення t дозволяє вектору намагніченості релаксувати у напрямку до рівноважного положення уздовж осі +z доти, поки він не перетне площину х-у (Рис. 6.42). У цій точці починається послідовність HMQC. Оскільки в цей момент відсутня поздовжня намагніченість, що пов'язана з ¹Н-¹²С, для цих спінів не генерується поперечна намагніченість, тобто відбувається необхідне придушення сигналу. Під час детектування та наступного періоду інверсії-відновлення, намагніченість ¹Н-¹³С, оскільки вона не інвертується імпульсом BIRD, просто релаксує до рівноважного значення, і підготовлюється до наступного циклу послідовності.

Рис.6.41.Варіант експерименту HMQC з BIRD. Послідовності HMQC передує елемент BIRD для інверсії сигналів і затримка t для їхнього відновлення. Ця процедура, в остаточному підсумку, веде до насичення небажаних вихідних сигналів.

Рис. 6.42.Усунення вихідних 'H-¹²C протонних сигналів за допомогою послідовності інверсії - відновлення BIRD. Спочатку збору даних не існує ніякої поздовжньої протонної намагніченості, але через процес спінової релаксації вона з'являється протягом періоду збору даних і подальшого релаксаційного проміжку (RD). Елемент BIRD селективно інвертує намагніченість тільки тих протонів, які пов'язані з ¹²С. Надалі, в період t відбувається релаксація цієї намагніченості. При відповідному виборі t, намагніченість 'H-¹²C не має поздовжнього компонента в момент старту HMQC, тому вона не дає внеску в СВІ, що детектується.

Насправді імпульс BIRD є складеним імпульсом (Рис. 6.41). Він використовується в ЯМР для диференціації спінів, які мають гетероядерне розщеплення від тих, які такого розщеплення не мають. Вплив імпульсу сильно залежить від фази імпульсів, що входять у кластер, тому тут ми зупинимося на селективній інверсії, що описана вище. Для спрощення картини розглянемо протонні імпульси, які мають фази х, у, х (аналогічні результати виходять і для фаз х,х,-х). На схемі (Рис. 6.43) послідовність починається із протонного збуджуючого імпульсу з наступною спіновою луною. Оскільки протони, що пов'язані з ¹²С не мають гетероядерного розщеплення через один зв'язок, протягом періоду D еволюціонують тільки їхні хімічні зсуви. Вони повністю рефокусуються 180^о-імпульсом на частоті протонів. Тому другий 90^о імпульс, який подається наприкінці другого періоду D, розташовує вектор уздовж осі –z і викликає необхідну інверсію сигналів ¹Н-¹²С. Для тих спінів, які мають гетероядерне розщеплення, хімічні зсуви також рефокусуються, тому для них можна враховувати тільки ефект розщеплення.

Рис. 6.43. Селективна інверсія протонів, пов'язаних з ¹²С за допомогою елемента BIRD. Послідовність рефокусує еволюцію протонних хімічних зсувів, а гетероядерні розщеплення через один зв'язок продовжують свою еволюцію.

Якщо вибрати D відповідною 1/2J_СН, безпосередньо перед 180^о імпульсами одержимо для

протонів два вектори, спрямовані в напрямках +х. Після імпульсів компоненти намагніченості, які пов'язані з розщепленням, продовжують еволюціонувати. Так, наприкінці періоду 2D дублет векторів розташовується уздовж напрямку –у. Він потім вертається до +z шляхом впливу фінального протонного імпульсу. Ці спіни поводяться так, начебто імпульс BIRD на них не впливав.

Схема BIRD є досить ефективною для придушення непотрібних сигналів ¹Н-¹²С, що викликають t₁-шум. Вона широко використовується для вивчення малих молекул. Однак даний метод непридатний для вивчення макромолекул, оскільки під час періоду t генеруються негативні сигнали ЯЕО, що приводить до зменшення інтенсивності протонних сигналів і відповідного падіння чутливості. Традиційний підхід до вивчення великих молекул при відсутності градієнтного датчика - використання сильного спінового замка під час дії першої послідовності INEPT в експерименті HSQC. При цьому зникає будь-яка намагніченість, що не відповідає параметрам спінового замка, а це веде до придушення небажаних сигналів.