Методи видалення зі спектрів сигналів 1H-12C 1H-14N.

Послідовність HMQC дозволяє детектувати сигнали тільки тих протонів, які мають зв'язок з гетероядрами зі спіном ½, іншими словами тільки сателіти в протонному спектрі. У випадку ¹³С це означає, що тільки один з 100 протонів дає внесок у двомірний спектр (інші 99% зв'язані з немагнітними ядрами ¹²С). Для ¹⁵N, де природний вміст ізотопу становить лише 0,37%, тільки одне ядро з 300 дає внесок у двомірний спектр. Коли записується спектр HMQC, всі протони дають сигнал на приймачі приладу, тому небажаний сигнал з переважаючою інтенсивністю повинен бути вилученим зі спектра за допомогою підходящого фазового циклу, або імпульсних градієнтів поля. Це дозволяє виявити кореляційні піки. Фазовий цикл базується на інвертуванні фази першого імпульсу на ядрах ¹³С у кожній парі сканів. При цьому фаза ¹³С сателітів інвертується, у той час як для сигналу протонів, що пов'язані з ¹²С вона залишається незмінною. Одночасне інвертування фази приймача приводить до зникнення небажаних сигналів і додавання інтенсивності потрібних сателітів (Рис.6.34). Двохкрокова процедура є основою фазового циклу в експерименті HMQC, що представлений вище на рис. 6.32.

Рис. 6.34.Селекція сателітних сигналів в експерименті HMQC за допомогою фазового циклу. Фаза ¹³С сателітів може бути інвертованою за допомогою інвертування фази першого 90^о вуглецевого імпульсу (порівняєте а та б). Віднімання цих двох наборів даних з одночасним інвертуванням фази приймача, видаляє вихідний сигнал ¹Н-¹²C, але підсилює сигнали сателітів (в).

Оскільки немагнітних ядер ¹²С набагато більше, ніж магнітних, проблемою в даному експерименті є достатньо повне придушення небажаних сигналів. Це виявляється неможливим за допомогою одного тільки фазового циклу. Тому в спектрі можуть виникнути значні шуми, що приводить до маскування слабких кореляцій. Перебороти даний ефект можна збільшенням часу експерименту або використанням більш ефективного методу селекції, чи фазового циклу з подвійним виділенням.

6.4.4. Гетероядерна одноквантова кореляція (HSQC)

Експеримент з гетероядерної одноквантової кореляції проводиться за загальною схемою, що представлена на рис. 6.1г, але відрізняється від експерименту HМQC тим, що під час періоду t₁ індукується не багатоквантова когерентність ¹Н-Х, а тільки поперечна одноквантова намагніченість гетероядра (Sp=+1), як показано на рис. 6.35. Послідовність починається зі збудження протонів за допомогою першого 90^о імпульсу. Після цього послідовність містить елемент спінової луни, в якому період D=1/2J_CH. В середині цього періоду міститься 180^о імпульс на частоті вуглецю, що рефокусує гетероядерні КССВ. Таким чином, наприкінці періоду D вектори намагніченості протонів, що відповідають гетероядерній взаємодії, розташовуються антипаралельно вздовж осі х. Одночасна подача 90^о імпульсів на частотах протонів та ядер вуглецю, з одного боку, спрямовує вектори протонної намагніченості вздовж осі +z, що забезпечує перенесення поляризації від протонів до вуглецю, а з другого – переносить в поперечну площину намагніченість ядер вуглецю. У наступний період часу t₁ протонна намагніченість не еволюціонує, оскільки вона виведена з поперечної площини. В цей період еволюціонує лише вуглецева намагніченість, відповідно до хімічних зсувів та КССВ ядер вуглецю. 180^о імпульс на частоті протонів у середині цього періоду рефокусує взаємодію ¹Н-Х. Таким чином, при розв'язці взаємодії ¹Н-Х у вимірі f₁ залишаються тільки гетероядерні хімічні зсуви. Після закінчення періоду t₁ гетероядерна намагніченість перетворюється в протонну за допомогою кроку зворотного INEPT. Він складається з двох 90^о імпульсів на протонах та на ядрах вуглецю та наступного елементу спінової луни. Імпульс на протонах переносить протифазні компоненти намагніченості від осі +z до осі у, а імпульс на ядрах вуглецю здійснює перенесення поляризації від атомів вуглецю на зв’язані з ними протони, що забезпечує модуляцію (помітку) протонної намагніченості частотами хімічних зсувів ядер атомів вуглецю. Спінова луна забезпечує рефокусування гетероядерних КССВ на початку збору даних. Протонна намагніченість із неінвертованою фазою, детектується при одночасному декаплінгу на частоті Х. Базовий двохкроковий фазовий цикл, аналогічний до того, що використовувався в HMQC, включає інверсію першого імпульсу з одночасною інверсією фази приймача.

Рис 6.35.Експеримент HSQC і використаний ним шлях перенесення когерентності. Для генерації поперечної X намагніченості експеримент включає послідовність INEPT. Створена нею намагніченість після періоду еволюції переноситься назад на протон за допомогою кроку зворотного INEPT. Зверніть увагу на те, що, на відміну від HMQC, протягом t₁ еволюціонує тільки одноквантова когерентність X (див. текст).

Хоча послідовність HSQC дає ті ж кореляції, що й HMQC, однак не містить гомоядерних ¹Н-¹Н взаємодій у вимірі f₁. Це відбувається тому що в період t₁ відбувається еволюція тільки намагніченості ядра Х, внаслідок чого на неї не впливають гомоядерні розщеплення. При цьому підвищується розділення у даному вимірі, що є принципово важливим для невеликих молекул (Рис.6.36.)

Рис. 6.36.Порівняння експериментальних кроспіків, що містяться у спектрах HMQC і HSQC, які отримані в ідентичних умовах високого f₁ розділення (2.5 Гц/точка). Верхні 1D зрізи відповідають 1D протонному спектру, а вертикальні зрізи – проекції f₁ 2D спектра. Додаткове уширення в спектрі HMQC виникає через гомоядерні протонні розщеплення в f₁.

Потенційно більш високе розділення уздовж f₁ для HSQC робить цей метод кращим для погано розділених спектрів, хоча в багатьох випадках для малих молекул розділення не є істотним і можна застосовувати обидва методи. Найбільш істотною відмінністю методу HSQC у порівнянні з HMQC є більша кількість імпульсів, особливо 180^о імпульсів на гетероядрах. Це веде до втрати інтенсивності сигналу під дією негомогенності радіочастотних імпульсів, їхньої недосконалості і позарезонансного збудження. Ефект має більше значення для ¹³С ніж для ¹⁵N через більший розкид частот резонансу. Втрати інтенсивності можна мінімізувати шляхом ретельного підстроювання датчика і, якщо це необхідно, використанням композитних імпульсів. Як і у випадку HMQC, в даному методі потрібне придушення небажаних сигналів основного ізотопного компонента.