Гетероядерна кореляційна спектроскопія з кореляцією через один зв'язок.

Оскільки сьогодні серйозні дослідження базуються майже виключно на обернених методах детектування, саме ці методи ми і будемо обговорювати в першу чергу. Традиційний метод з детектуванням на ядрах ¹³С зараз використовується лише на застарілих приладах і скоро, вочевидь, матиме лише історичний інтерес. Ви обговоримо цей метод наприкінці розділу, оскільки його доводиться використовувати за відсутності нового спектрометра.

Існують дві загальноприйняті методики для реалізації гетероядерної кореляції хімічних зсувів через один зв'язок, відомі під абревіатурами HMQC і HSQC. Кореляційні дані, що можна отримати за допомогою цих двох методів, практично еквівалентні. Методи розрізняються лише на останньому етапі, що для рутинних експериментів має лише невелике значення. Історично метод HMQC частіше використовують хіміки, а метод HSQC більше розповсюджений серед біологів. Це обумовлено частково тим, що HMQC частіше використовують для кореляцій ¹Н-¹³С у малих молекулах, а HSQC – для ¹Н – ¹⁵N кореляцій у білках. Із практичної точки зору метод HMQC менш чутливий до недосконалості експерименту, а метод HSQC має переваги при необхідності дуже високого розділення і легше піддається модифікації імпульсної послідовності.

Обидві методики є оптимальним підходом до встановлення зв’язаності між гетероатомами при детектуванні на протонах і відповідають схемі 6.30г. Як і всі гетероядерні експерименти, даний підхід має певні технічні труднощі, пов'язані з придушенням материнського сигналу, що відповідає протонам, які мають хімічний зв'язок зі спіном, відмінним від ½ (¹Н-¹²С, ¹Н-¹⁴N). Їхній сигнал є домінуючим в протонному спектрі, але підлягає видаленню при гетероядерних кореляціях, оскільки лише слабоінтенсивні сателіти сигналу несуть необхідну кореляційну інформацію. Традиційним методом видалення материнських сигналів є застосування спеціальних фазових циклів. Але таким методом не вдавалося отримати спектри, що повністю позбавлені артефактів. Прорив у використанні методу був зроблений завдяки застосуванню імпульсних градієнтів поля, які, як це ми вже неодноразово бачили, мають величезне значення для багатьох методик сучасної спектроскопії ЯМР.

6.4.3. Гетероядерна багатоквантова кореляція (HMQC)

Експеримент з гетероядерної багатоквантової кореляції є одним із двох експериментів з детектуванням на протонах, що широко використовуються для знаходження кореляцій через один зв'язок. Хоча експеримент був запропонований багато років тому, однак він не мав поширення, доки не були переборені технічні труднощі по видаленню зі спектра сигналу протонів для пар ¹Н-¹²С, інтенсивність якого в багато разів переважає інтенсивність сигналів в парах ¹Н-¹³С. Лише після впровадження в спектроскопію методу ІГП він став домінувати в спектроскопії ЯМР органічних сполук.

Для того, щоб одразу дати читачеві змогу зрозуміти, наскільки важливу інформацію можна отримати зі спектра HMQC, наведемо двомірний HMQC спектр для простої, але важливої сполуки - ментолу 6.7, яку ми вже неодноразово використовували для ілюстрації дії імпульсних послідовностей J-розділеної спектроскопії (Рис. 6.31).

6.7.

Рис.6.31.Кореляції через один зв'язок у спектрі HMQC на 500 МГц ментолу 6.7. Для порівняння показані також одномірні протонний і вуглецевий спектри.

Двомірний кореляційний спектр є виключно простим для інтерпретації. В одному вимірі він містить сигнали атомів вуглецю за умов повної розв’язки від протонів, а у другому вимірі – звичайний протонний спектр. Координати кроспіку відповідають хімічним зсувам в протонному та вуглецевому спектрах, між якими він виник. Найлегше всього уявити собі природу кореляцій, якщо ці спектри зображені вздовж осей двомірного спектра у відповідному масштабі. Немає якогось усталеного розташування осей в спектрах HMQC. Вісь протонів може бути як вертикальною, так і горизонтальною, в залежності від уподобань спектроскопіста. Але це жодним чином не впливає на результати аналізу спектру. Якщо сигналів в протонному та вуглецевому спектрах не занадто багато, кореляції можна зробити візуально. Якщо ж спектр хоча б по одній осі містить сигнали, що близькі за хімічними зсувами, слід провести вертикальну та горизонтальну лінії від кроспіка до відповідних шкал, чи сигналів в одномірних спектрах, що містяться біля осей (якщо вони записані). Знайдені у такий спосіб координати кроспіка слід порівняти з відповідними одномірними спектрами, що записані у відповідному масштабі. Рисунок ілюструє три найбільш важливі результати експерименту. По-перше, з'являється можливість використання знайдених раніше віднесень протонних сигналів для віднесення сигналів у спектрах гетероядер. Такий підхід веде до значно більшої певності структурних висновків. Немає іншого методу, за допомогою якого було б настільки просто віднести сигнали у вуглецевому спектрі. По-друге, з'являється можливість рознесення нерозділених протонних сигналів у другому вимірі відповідно до хімічних зсувів гетероядра. Це дозволяє уточнити віднесення в протонному спектрі. Наприклад, область між 0,7 і 1,2 м.ч. на рис. 6.31. містить ряд протонних сигналів, що перекриваються і погано піддаються аналізу навіть на частоті 500 МГц. Повна картина цих сигналів видна в другому вимірі, що дозволяє ідентифікувати і віднести всі 7 сигналів.

Цінність такого підходу зростає при ускладненні структури молекули і зростанні числа сигналів, що перекриваються. Останній аспект експерименту може бути винятково корисним для структурних віднесень, оскільки з’являється можливість ідентифікувати діастереотопні гемінальні пари. Їх не завжди легко ідентифікувати за COSY спектром, тому що гемінальні та віцинальні КССВ можуть мати однакові величини. Тільки для гемінальних пар мають місце дві кореляції з одним вуглецевим атомом.На рис.6.31. це спостерігається для С6, С4 і С3. На відміну від попередніх гомоядерних 2D спектрів, що наведені у цій книзі, гетероядерні кореляційні спектри не містять діагональних піків і не симетричні відносно діагоналі. Це є наслідком того, що у двох вимірах представлені різні ядра і не існує компонентів намагніченості, які б у періоди змішування та детектування мали б однакові частоти.