Градієнтна селекція цільових сигналів в методах HMQC/HSQC.

Імпульсні градієнти поля, безперечно, є найкращим методом придушення сигналів (Рис.6.37г). Ступінь ослаблення залишкового сигналу становить 1000:1 навіть у випадку одиничного скану. Це означає практично повне придушення вихідних сигналів ¹Н-¹²С або ¹Н-¹⁴N. Фазове циклування стає непотрібним, оскільки виділення сигналів за допомогою градієнтного рефокусування виявляється цілком достатнім. У випадках наявності великої кількості зразка експеримент може бути проведений усього за кілька десятків хвилин.

Послідовність для градієнтної селекції включає комбінацію градієнтних імпульсів, що рефокусує тільки певні сигнали. Схема на Рис.6.38 придатна для збору даних тільки в абсолютних значеннях, оскільки вона виділяє лише один шлях перенесення намагніченості ¹³С за період t₁. Для того, щоб зрозуміти процес селекції сигналу за допомогою ІГП слід враховувати, що дія кожного градієнта залежить від порядку когерентності Р (як це представлено на шляху перенесення когерентності) і гіромагнітного відношення наявних спінів. Треба врахувати, що представлений шлях перенесення когерентності стосується тільки когерентності, яку ми хочемо виділити. Інші типи когерентності не показані, оскільки вони не виділяються. Всі градієнти, що використані в експерименті, мають однаковий профіль і тривалість, а відрізняються тільки потужністю, G_n. Перший градієнт на Рис. 6.38а діє в той момент, коли як протони так і атоми вуглецю мають порядок когерентності р=+1 (гетероядерна двохквантова когерентність). Тому вплив першого градієнта на фазу сигналу можна записати як Ф1 = G₁(g_H + g_C). Аналогічно, для другого градієнта Ф2 = G₂(-g_H + g_C), для третього Ф3 = G₃(-g_H). Для того, щоб виділити даний шлях перенесення когерентності загальна фаза, індукована градієнтами, повинна бути нульовою:

Ф1 + Ф2 + Ф3 = G₁(g_H + g_C) + G₂(-g_H + g_C) + G₃(-g_H) = 0 (6.2)

Відзначимо, що в гетероядерних експериментах важливі тільки відношення величин g, а оскільки, g_Н/g_С = 4 то дане рівняння можна спростити:

G₁(5) + G₂(-3) + G₃(-4) = 0 (6.3)

Існує ряд співвідношень градієнтів, які задовольняють даному рівнянню і приводять до необхідної селекції сигналів, наприклад 2:2:1, 5:3:4 або 3:5:0.

Оптимальний варіант у присутності різних експериментальних недосконалостей детально описаний у літературі, але автори рекомендують використовувати співвідношення 3:5:0 (тобто використовувати тільки два градієнтних імпульси). При підходящому співвідношенні градієнтів для необхідного придушення сигналів залишається вибрати тільки їх оптимальну потужність.

Рис. 6.38.Послідовність експерименту HMQC із градієнтним відбором. Послідовність (a) придатна для збору даних в абсолютних значеннях. Послідовність (б) забезпечує одержання фазочутливих даних за допомогою процедури луни-антилуни. Селекція шляхів N- і P-типу здійснюється за допомогою останнього градієнта. Перші два градієнти, що потрібні для рефокусування еволюції хімічних зсувів, розміщені усередині фрагмента спінової луни.

Той підхід, коли накопичуються абсолютні значення даних дозволяє визначати тільки магнітуди сигналів. Він придатний для автоматизованих вимірювань рутинних спектрів, коли розділення і чутливість не є критичними. Для проведення фазочутливого експерименту необхідно зберегти як N так і Р шляхи перенесення намагніченості ядер ¹³С під час t₁. Це принципово неможливо для єдиного скану, якщо градієнти подаються під час t₁, оскільки ніяка комбінація градієнтів не може рефокусувати одночасно намагніченості що відповідають шляхам +1 і -1.

Наприклад, сумарний ефект комбінації градієнтів 2:2:1 на шлях Р для ядер ¹³С (порядок когерентності під час t₁ дорівнює –1) буде:

G₁(g_H + g_C) + G₂(-g_H + g_C) + G₃(-g_H) = (2 х 3)+(2 х –5)+(1 х –4) = -8 (6.4)

І сигнал залишається розфазованим. Існує два основних підходи для обходу цього обмеження – або виключити використання градієнтів під час періоду t₁, що дає можливість використовувати методики Стата або TPPI квадратурного детектування або здійснювати збір даних для N і Р – типів сигналів в альтернуючих сканах і комбінувати їх за методом луна-антилуна. На Рис. 6.38б наведена схема, що базується на цьому методі. Для одержання повністю зфазованого спектра потрібне рефокусування еволюції хімічних зсувів ¹³С, що відбувається під час градієнтних імпульсів. Із цією метою використовується цикл додаткової спінової луни усередині t₁ (порівняйте з послідовністю, що наведена на Рис.6.38а). Сигнали із двома різними шляхами перенесення намагніченості збираються окремо за допомогою інвертування знака останнього градієнта. При цьому, наприклад, сигнал N-типу рефокусується при співвідношенні градієнтів 2:2:-1, а сигнал Р-типу при співвідношенні градієнтів 2:2:1 (слід зазначити, що фаза сигналів при даному методі селекції протилежна до тієї, котра зображена на Рис. 6.38а, оскільки для ¹³С використовувався додатковий 180^о імпульс).

Рис.6.39.Послідовність, фазочутливого HSQC із градієнтним відбором використовує підхід луна-антилуна. N- і -P-шляхи виділяються за допомогою останнього градієнта.

Аналогічні підходи справедливі і для градієнтної селекції в експерименті HSQC. Тут також описаний ряд варіантів градієнтної селекції. Зручна послідовність, що включає комбінацію луна-антилуна проілюстрована на рис. 6.39. Вона включає всього два градієнти, що є пропорційними гіромагнітному співвідношенню Х і ¹Н. Кожний з них впливає тільки на одноквантову намагніченість ядер Х і ¹Н. Так, для кореляційного експерименту ¹Н-¹³С відношення градієнтів 4:1 і 4:-1 виділяють при альтернуванні сканів N і Р-типи когерентності. Після впливу першого градієнта діє спінова луна, що рефокусує хімічні зсуви спінів Х, які еволюціонували під час градієнтного впливу. Другий градієнтний імпульс подається під час звичайного періоду рефокусування фрагмента INEPT.

Здатність повністю придушувати вихідні ¹Н-¹²С і ¹Н-¹⁴N сигнали дозволяє практично повністю виключити шум у спектрі Це ілюструється на Рис. 6.40, де зображений фрагмент спектра HSQC ¹Н-¹⁵N для пептиду 6.8 із градієнтною селекцією сигналу і декаплінгом на ¹⁵N. Записано спектри з контурними лініями на рівні теплового шуму та обраними оптимально.

Рис. 6.40.Спектр HSQC карбопептоїду 6.8 при природному вмісті ¹⁵N із градієнтним відбором. Для того, щоб показати рівень теплового шуму показані глибокі та високі контурні лінії. Артефакти t_1-шуму від залишкових сигналів 'H-¹⁴N у спектрі відсутні (хімічні зсуви ¹⁵N виміряні відносно рідкого аміаку, що взятий як зовнішній стандарт).