Вимірювання Т2 за допомогою послідовності спінової луни

Вимірювання істинного часу поперечної релаксації Т₂ у принципі можна здійснити, якщо видалити внесок у релаксацію неоднорідності магнітного поля. Як було показано у 1 розділі, це можна здійснити за допомогою послідовності спінової луни. Уявімо собі, що досліджуваний зразок можна розділити на мікроскопічні області, у межах яких неоднорідність поля відсутня. Вектори намагніченості ядер у межах таких областей будуть мати однакові частоти прецесії. При дії базової послідовності спінової луни (Рис. 4.9а) вектори намагніченості в одних областях за час періоду t рухаються з випередженням, інші ж за цей час трохи відстають (Рис. 4.10).

Рис. 4.9. Послідовність спінової луни для вимірювання часу релаксації T₂. (a) Базова послідовність спінової луни, (б) послідовність Карра-Парсела і (в) послідовність Карра-Парсела-Мейбаума-Жилла (CPMG).

Рис. 4.10.Рефокусування за допомогою спінової луни векторів намагніченості, розфазованих через неоднорідність магнітного поля.

180^о імпульс обертає вектори навколо напрямку осі -у. Після цього, наприкінці наступного періоду t найбільш швидкі вектори зійдуться з найбільш повільними і розташуються уздовж осі -у. Таким чином, спінова луна рефокусує у площині х-у розфазування векторів, пов'язане з неоднорідностями магнітного поля. Якщо проводити збір даних одразу після подачі 90^о імпульсу, будемо бачити початковий сигнал СВІ. Цей же сигнал у вигляді луни повторюється через інтервал 2t (Рис. 4.11а). Однак, за період 2t відбувається також і деяка втрата фазової когерентності, яка пов'язана із природною поперечною релаксацією. Вона не рефокусується за допомогою спінової луни. Тому спостерігається спад намагніченості у згоді з часом природної поперечної релаксації Т₂, що не залежить від неоднорідності поля. Це добре видно, якщо під час збору даних прикласти декілька 180^о імпульсів, що відстоять на 2t (Рис. 4.11б).

Рис. 4.11.Експериментальне спостереження спінової-луни, (a) Збір даних був початий негайно після 90° збуджуючого імпульсу. При дії 180° імпульсу відбувається рефокусування намагніченості і, відповідно, відновлюється інтенсивність СВІ, пов'язаної із втратами когерентності через неоднорідності поля, (б) Серія спінових лун виявляє істинну релаксацію T₂ (пунктирна лінія).

Для визначення Т₂ можна провести уявний експеримент, у якому послідовність повторюється для t, що послідовно зростають і будується залежність амплітуди луни від часу аналогічно до того, як це вище було описано для методу інверсії-відновлення. Однак такий підхід слід застосовувати з певною обережністю, оскільки для його успіху потрібно, щоб під час дії всієї послідовності не відбувалось переходу спінів з однієї області зі сталим магнітним полем в іншу. Якщо під час дії послідовності відбувається дифузія спінів з однієї області в сусідню, то вони попадають у трохи відмінне магнітне поле, внаслідок чого повне рефокусування для них спостерігатися не буде. При зростанні t такі дифузійні втрати зростають і отримані релаксаційні дані стають менш достовірними (цей метод лежить в основі вимірювання молекулярної дифузії в розчині).

Кращим є підхід для визначення величин Т₂, що мінімізує ефекти дифузії. Він полягає в повторенні послідовності луни в рамках одного експерименту. У цьому випадку можна отримати множинні луни при малих t. Спад цих лун дає часову константу Т₂. Ця послідовність називається послідовністю Карра-Парсела (Рис. 4.11б). Під час цієї послідовності луна при кожному рефокусуючому імпульсі створюється почергово уздовж осей +у і -у. Втрати, зв'язані зі спіновою дифузією, виникають за період 2 t. Якщо цей період малий у порівнянні зі швидкістю дифузії (звичайна величина t становить 100 мс), ці втрати стають настільки малими, що ними можна знехтувати. Для більших затримок сигнал луни послаблюється через багаторазове повторення фрагмента t-180- t. Проблемою даного методу є те, що в ньому неприпустимі відхилення імпульсу від 180^о, оскільки при цьому неточності рефокусування накопичуються від імпульсу до імпульсу. Тому застосовується поліпшена схема експерименту, відома як метод Карра-Парсела-Мейбаума-Жилла (CPMG), Рис. 4.11в. За цією схемою відбувається почергова подача імпульсів 180^о_х та 180^о_у. Рефокусування при цьому для кожної луни відбувається по осі +у. При цьому помилки не накопичуються, а мають постійну величину для кожної непарної луни і знищуються для кожної парної луни (Рис. 4.12).

Рис. 4.12.Дія послідовності CPMG при недосконалості імпульсів. Якщо 180° імпульс є на a^o коротшим ніж потрібно, то вектори намагніченості при його дії розташуються вище (темно-сіра стрілка) і нижче (світло-сіра стрілка) площини х-у.Тому інтенсивності непарних лун будуть заниженими. Якщо луна повторюється, помилка усувається, оскільки наступний 180° імпульс має таку ж похибку. Таким чином, для точного визначення часу релаксації T₂ слід використовувати парні луни.

Т₂ можна одержати, якщо провести серію експериментів зі зростаючою величиною 2 tn (n зростає від експерименту до експерименту) і збором у кожному випадку даних від останньої парної луни. Застосування послідовності CPMG показано на Рис. 4.13 для зразка з лініями різної ширини.

Рис. 4.13.CPMG спектри пентапептиду Leu-енкефаліну 4.3в DMSO. Дуже швидкий спад слабопольного сигналу амідного протона відбувається через його участь у швидкому хімічному обміні з водою, внаслідок чого сигнал є сильно уширеним. Числа відповідають часу релаксації T₂ .

4.3.

Тут можна бачити більш швидкий спад інтенсивності сигналів широких ліній, які мають менші величини Т₂. На практиці визначення Т₂ кожним з описаних методів не є прямим. Найбільш важливою проблемою є наявність гомоядерних КССВ, які не рефокусуються спіновою луною і приводять до появи додаткової фазової модуляції сигналу, що детектується. У результаті цього, дослідження, пов'язані з вимірюванням Т₂, проводяться більш рідко, ніж вимірювання Т₁. З погляду сучасної спектроскопії ЯМР, величини Т₂ не занадто інформативні. Замість них досить знаходити величини Т*₂, які, як показано вище, можна визначити безпосередньо із ширини піків. Оскільки ці величини відповідають швидкості спаду поперечної намагніченості, то вони визначають, можливу тривалість багатоімпульсного експерименту до того моменту як сигнал повністю зникне.

4.5. Редагування спектрів за Т₂

Одна із цікавих методик застосування спінової луни заснована на використанні великої різниці часів поперечної релаксації різних часток. Більші молекули, як правило, дають більш широкі сигнали в спектрах ЯМР у порівнянні з малими молекулами, для яких часи релаксації більші.

Якщо різниця Т₂ виявляється досить великою, то за допомогою послідовності CPMG можна зменшити інтенсивність сигналів компонентів, що релаксують швидко і отримати спектр тільки того компонента, що релаксує повільно (Рис. 4.14).

Рис. 4.14.Т₂ фільтр. Широкий сигнал полістиролу (Mr = 50,000) в (a) усунутий в (б) за допомогою послідовності CPMG. При цьому в спектрі залишаються тільки сигнали менших за розміром молекул камфори. Затримка t становила 1.5 мс і луна була повторена 150 разів для того, щоб сумарний період релаксаційної затримки становив 450 мс.

Таким чином, з'являється можливість редагування спектра суміші, залежно від молекулярної маси складових компонентів. Такий підхід широко використовується при аналізі біологічних рідин для виключення зі спектра неінформативних інтенсивних сигналів таких речовин як ліпіди і протеїни.

Аналогічним методом можна селективно ослабити в спектрі інтенсивний сигнал води, якщо зменшити час релаксації її протонів (тобто уширити її сигнал) до величин, значно менших, ніж у розчинених речовин. Цього можна досягти за допомогою додавання до розчину підходящого парамагнітного релаксаційного реагенту, що включає воду у свою гідратну оболонку, або реагенту, що прискорює протонний обмін. Із цією метою використовуються хлорид амонію і гідроксиламін. Це показано на Рис. 4.15 для спектра пептиду аргінінвазопресину в 90% воді.

Рис. 4.15.Ослаблення сигналу розчинника методом WATR. (a) одномірний протонний спектр 8м розчину відновленого аргінін - вазопресину в 90% H₂O/10% D₂O, pН = 2.75 утримується за допомогою 0.2 M NH₂OH. (б) Такий же зразок записаний з послідовністю CPMG із сумарною затримкою 235 мс

Даний метод ослаблення сигналу розчинника називається WATR (water attenuation by transverse relaxation). Незважаючи на вражаючі результати, метод має обмежене застосування.