Тема: Мікроклональне розмноження рослин.

Технологія мікроклонального розмноження рослин складається з таких основних етапів:

1.Підбір експлантів і введення їх в культуру.

2.Активація розвитку пагонів з експланту при підвищеній концентрації цитокінінів живильного середовища.

3.Укорінення пагонів при збільшенній концентрації ауксинів в поживному середовищі.

4.Переведення одержаних рослин із стерильних умов у грунт, їх адаптація (перенесення з умов ін вітро в умови ін віво).

2. Найбільш важливим моментом є вибір материнської рослини і експланту. Термін «експлант» застосовують для назви вихідного шматочка рослини, який вводять в культуру ін вітро. В якості експлантів використовують верхівки пагонів, бокові бруньки, частинки кореня або листка, черешок листка, суцвіття, пелюстки квітів, гіпокотиль проростаючого насіння та інші частини рослин.

Для успішного проведення робіт з регенерації рослин вибір експлантів відіграє першорядне значення. Краще всього використовувати матеріал вилучений з здорових, сильних рослин. Вибір експланта залежить від виду, стану рослини-донора, фази її розвитку, сезону року. Значення має навіть положення експланта на рослині. Так, верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість розмноження, ніж верхівки з нижніх гілок. Більшість експлантів добре вводяться в культуру у фазу активного росту донорської рослини. Проте є рослини, експланти з яких утворюють пагони лише в стані спокою. Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точко зору здатності до морфогенезу ін вітро, ніж старіючі, зрілі тканини та органи. Більше того, при виборі експлантів слід віддавати перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають у культурі, мають більшу швидкість росту і тотипотентність. Розмір експланта теж визначає ступінь виживання ін вітро (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають).

Донорські рослини, з яких збираються вилучити експланти, вирощують у якомога чистому середовищі, уникаючи надмірного поливання, забруднення пагонів і листків. Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу перед введенням його в культуру ін вітро.

Таким чином, відібраний і простерилізований експлант вводиться в культуру на спеціальне поживне середовище.

3. Всі рослини ростуть завдяки активності їх верхівкових меристем. Такі меристематичні тканини знаходяться на кінчику основного пагона, в пазухових бруньках, зародку – класичних експлантах для мікроклонального розмноження рослин .

Брунька – це зачатковий, нерозвинений пагін з дуже вкороченими міжвузлями. Вона складається з меристематичної зачаткової осі, яка закінчується конусом наростання. Нижче конуса наростання закладаються зачатки листків, різні за віком і розміром. Листки розташовані в брунці один над одним. В пазухах зачасткових листків (примордіїв) утворюються горбочки – зачатки бічних (пазушних) бруньок. Отже вегетативні бруньки можуть бути верхівочними (апікальними) і пазушними, розташованими в пазухах листків або брунькових лусочок.

Поніття апекс і конус наростання не можна ототожнювати. Пояснюється це тим, що під конусом наростання розуміють лише верхню (часто конусоподібну) частину апекса, де немає листкових зачатків (вище примордіальної зони) апекса. Тобто, під апексом мається на увазі цілий комплекс меристематичних клітин з різними функціями. Апекс – це частина бруньки, ростовий центр пагона. Завдяки діяльності його клітин формуються первинні тканини всіх органів, тобто йому властиві як гістогенні, так і оганогенні процеси.

Таким чином, якщо наш експлант – верхівка пагона 0,25-0,30 мм у довжину, то в пазухах його зачаткових листочків знаходяться додаткові меристематичні тканини, які здатні формувати нові пагони. На другому етапі при підвищеній концентрації цитокінінів поживного середовища, долається ефект апікального домінування в умовах ін вітро і утворюється цілий пучок пагонів першого, другого, третього і т.д. порядку. Цей процес називається проліферацією пагонів ін вітро.

Утворені пагони знову пересаджуються на те саме поживне середовищедля подальшого одержання нових пагонів з його пазухових бруньок. Подібний процес можна продовжувати і одержувати величезні кількості пагонівза відносно короткий період часу.

Метод проліферації пазухових пагонів з апексів або бруньок є найбільш поширеним у практиці мікроклонального розмноження різних видів рослин. При утворені пагонів, поживне середовище повинно містити цитокінінів більше ніж ауксинів. Це «золоте правило пагоноутворення»має винятки для деяких видів рослин. В культурі ін вітро використовують такі цитокініни: кінетин, зеатин, БАП; ауксини: ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д. Співвідношення цитокінін/ауксин підбирається для кожної культури експерементально.

Важливе значення для активації формування пагонів мають умови освітлення і температури. Світло необхідне для морфогенезу і утворення хлорофілу. Використовують, як правило, люменесцентні лампи з інтенсивністю світла 1000-1500 люкс. Оптимальним періодом освітленості для більшості рослин вважають проміжок часу 16 годин, температура

20-25 ºС.

Існує метод одержання пагонів з калусної тканини, який теж відноситься до мікроклонального розмноження, але мало застосовується, тому що може приводити до генетичних змін у новостворених рослин-регенерантів.

4. Після того, як утворилось багато пагонів, їх необхідно укорінити і одержати повноцінні рослини. Основні індуктори коренеутворення (ризогенезу) – ауксини. Для формування коренів пагони відділяють і висаджують на поживне середовище, яке містить ауксинів більше, ніж цитокінінів. Це основне правило коренеутворення ін вітро, яке має свої винятки. Під впливом ауксинів стимулюється поділ клітин паренхіми пагона, що приводить до диференціації кореневих зачатків в його базальній частині. Утворення адвентивних коренів може також спонтанно проходити при перенесенні пагонів на середовище без цитокінінів (особливо у однодольних рослин). Деякі дослідники вважають, що для індукції ризогенезу доцільно спочатку використовувати середовище без фітогормонів. Це пояснюється тим, що ефективність ауксинів при укоріненні зменшується під впливом цитокінінів попереднього етапу розмноження.

Ріст пагонів і їх подальше укорінення приводить до утворення невеличких рослин з 5-6 листочками. Стебло можна розрізати на 5-6 мікроживців, які у сприятливих умовах виростають до нормальних рослин. Процес дозволяє безперервно одержувати великі кількості рослин.

Укоріненість пагонів ін вітро залежить від кількості їх субкультивувань до укорінення: із збільшенням кількості пасажів укоріненість зростає і скорочуються строки появи коренів на пагонах.

Висновок: регенераційна здатність рослин залежить від таких чинників: виду рослини, місцеположення експланта на рослині, сезонності відбору експланта, складу поживного середовища, фізичних факторів (температури, освітленності, вологості), кількості субкультивувань і тривалості безпересадочного культивування.

5. Перенесення рослин з умов ін вітро в умови ін віво – важливий і найбільш трудомісткий заключний етап мікроклонального розмноження. Найкращим для пересадки є період, коли у рослини добре розростаються корені для поглинання мінеральних елементів грунту, а молоді листочки вже здатні до продуктивного фотосинтезу. Рослина стає повністю автотрофною для самостійног існування і її необхідно пересаджувати у природні умови.

Важливим аспектом роботи є вибір грунтового середовища у яке переноситься рослина, здебільшого це суміш торфу з піском, перлітом або вермикулітом. Наприклад для суниць, вишні, смородини використовують суміш – грунт : торф : пісок = 1:1:1. Перед висадкою у грунт корені рослин промивають у розчині фунгіциду (фундазол, каптан, бенолат). Висаджують не дуже загущено, щоб запобігти розвитку грибкових захворювань і сильному видовженню рослин у боротьбі за світло. У період вирощування щотижня рослини обприскують слабким розчином фунгіциду.

Фізіологічні особливості молодих листків (відсутність захисного воскового шару), а також кореневої системи (недостатньо закріплена у грунті, відсутність потужної зони кореневих волосків) не забезпечують нормального водного балансу рослин. Інтенсивна кутикулярна транспірація не компенсується надходженням води за допомогою тиску кореневої системи, що може призвести до прив’ядання і загибелі рослин. Саме тому високий рівень вологості (90-100%) повітря, у якому буде знаходитись рослина після пробірки – найважливіший фактор перших тижнів вирощування. Для цього використовують установки туманоутворення в теплицях, індивідуальне покривання рослин поліетеленовою плівкою або скляним посудом. Як правило, високий рівень вологості підтримують до утворення нового листка (два тижня і більше). Після цього рослини загартовують – готують до відкритого грунту: поступово знімають покриття з рослини і зменшують вологість до природньої. При загартуванні рослин, як останній фазі адаптації, необхідно приділяти увагу оптимальному живленню рослин. Надлишкове підживлення призводить до жирування рослин, вонистають надмірно рослими і погано приживаються після перенесення у відкритий грунт.

Якщо робота проводиться у великих промислових масштабах, то період адаптації рослин бажано спланувати і проводити з березня по вересень, що скоротить до мінімуму витрати. Рослини, одержані у зимовий період, зберігають у холоді (+5 º….+8 º) при освітленні, а весною проводять всі вищеназвані процедури із перенесенням в умовивільного існування.

6. Мікроклональне розмноження рослин – важливий метод масового вегетативного розмноження цінних з харчової, медичної, технічної або естетичної точки зору рослин. На сьогодні у світі широко клонують суницю, картоплю, орхідею, гвоздику, герберу, плодові ягідні, різні дерев’янисті і лікарські рослини. При масовому виробництві рослин важливе значення має генетична стабільність садивного матеріалу після всіх етапів мікророзмноження.

Для позначення рослин, одержаних безстатевим шляхом, у 1903 році К. Вебером був запропонований термін «клон» (від рецького klon – гілка, пагін, паросток) – ряд послідовних поколіньгенетично однорідних організмів, які утворюються в результаті вегетативного розмноження від одного загального предка. Наприклад, одержують лінію безвірусних мериклонів гвоздики – потомство однієї меристеми. Для мікроорганізмів клон – це сукупність нащадків однієї клітини-родоначальниці.

Сучасне уявлення про генетичний статус клонованих рослин, у відповідності із чіткою регенераційною здатністю тотипотентних клітин, передбачає одержання шляхом мітозу рослин, генетично ідентичних клітинам експланту материнської рослини. Практика виявила можливість появи змінених форм. Виділяють три основні категорії змін:

1.Генетичні, які пов'язані з плоїдністю, а також з хромосомними і генними мутаціями.

2.Фенотипічні – пов'язані з морфологічними і анотомічними характеристиками рослин.

3.Онтогенетичні – результат дезорганізації тканинних шарів у химерних рослин, або спонтанного зміщення груп клітин у вигляді ініціації росту адвентивних органів з різних шарів тканини.

Частота виникнення відхилень коливається в залежності від вищеназваної категорії, а також від виду рослини (від 0,03 до 15%). Генетична стабільність рослинного матеріалу ін вітро залежить від моделі розмноження. Найменша вірогідність генетичних змін спостерігається при масовому клонуванні рослин з нормальних меристем материнських рослин. Такі рослини називають «мериклонами» - клонами, які одержані з меристем рослини-донора.

Бажано уникати розмноження рослин через калусну тканину. Тривале переседжування калусу приведе до винекнення у клітинах різних явищ: зміна плоїдності, структурні перебудови хромосом, накопичення генних мутацій, зменшення або втрата морфогенетичного потенціалу. Саме тому регенерація рослин з калусної тканини часто призводить до виникнення організмів зміненої морфології (низькорослі, неправильне жилкування і розташування листків), зниженої життєздатності. Крім того, у системі калус-пагін організована структура пагона може відіграти своєрідну роль «органу-няньки» і впливати на процес органогенезу, стимулюючи меристематизацію калусних клітин, які в свою чергу, можуть давати початок органам із зміненими властивостями. Такий підхід використовується для одержання сомаклональних варіантів рослин.

Аналіз сучасних досліджень дозволяє зробити висновок, що для зниження частоти появи змінених форм у процесі мікророзмноження рослин необхідно:

· розмноження проводити на основі проліферації пазухових меристем;

· у процесі культивування вилучати всі бруньки калусного походження;

· вести розмноження по окремих мериклонах, щоб полегшити контроль за походженням рослин;

· регулярно перевіряти агробіологічні характеристики вибіркових екземплярівмериклонів.

Таким чином, навіть один цінний селекційний екземпляр можна зберегти і одержати велику кількість генетично ідентичних йому клоніврослин шляхом мікророзмноження.

7. Переваги мікроклонального розмноження:

Високий коефіцієнт розмноження. Метод клонального мікророзмноження дозволяє одержати до 1 млн. одиниць садивного матеріалу за один рік, що вже зроблено для суниці, гербери, хризантеми та ін. Рослин

Можливість розмноження протягом року незалежно від погодних умов. Наявність лабораторії і теплиці дозволяє це зробити.

Створення «банку» неінфікованого цінного селекційного матеріалу. У холодній кімнаті, при температурі +3º…+5ºС і освітленні, пробірочні рослини можуть зберігатися протягом декількох місяців без пересадки. Холодильник об’ємом 0,28 м³ вміщує до 2 тис. культуральних рослин. У відкритому грунті така ж кількість рослин займає від 5 до 6 га ( для плодових культур в залежності від схеми посадки).

Можливість широкого обміну рослинним матеріалом між регіонами і країнами. Зменшуються об’єми перевезення матеріалу, легше вирішуються карантинні питання.

Одержання безвірусного садивного матеріалу.

Щодо проблем, то для промислового впровадження мікророзмноження необхідно розробляти і вдосконалювати механізацію і автоматизацію основних етапів роботи. На сьогодні більшість процесів виконується вручну.

Вузьким місцем технології мікророзмноження деяких культур залишається пересадка пагонів безпосередньо у нестерильні умови для укорінення і одержання повноцінних рослин. Велике значення при цьому відіграють субстрат, пересадка рослин, умови оточуючого середовища.

В Україні створюються лабораторії мікроклонального розмноження, виходячи з потреб селекції і насінництва. У той же час могли б мати велике значення і комерційні фірми-лабораторії. Для їх організації повинно мати місце прогнозування рентабельності та виробництва виду продукції, риночна ціна, місткість ринку, сезонність постачання.