Тема: Одержання та культивування протопластів рослин.

1. Виділення і культивування протопластів;

2. Гібридизація соматичних клітин шляхом злиття ізольованих протопластів (соматична гібридизація рослин);

3. Методи злиття протопластів;

4. Аналіз соматичних гібридів

1. Структуру рослинної клітини можна умовно розділити і розглядати як дві важливі складові частинивміст і оболонка. Перша – протопласт включає ядро і цитоплазму, в якій знаходяться органели. Друга – оболонка (клітинна стінка), хімічну основу якої визначають полісахариди (целюлоза, геміцелюлоза і пектинові речовини).

Протопласти (від грецьк. protos – перший, plastos – утворений, виліплений) – клітини, які позбавлені своєї клітинної оболонки. Їх можна характеризувати як відокремлені мембраною ядро і цитоплазматичні утворення з власною структурною цілісністю і здатністю здійснювати активний метаболізм, біосинтез і трансформацію енергії.

В експерементальній цитології і фізіології рослин протопласт виявляється як морфологічно відокремлене утворення при плазмолізі: протопласт у гіпертонічному розчині віддає воду, зменшується в об’ємі і відокремлюється від клітинних стінок (згортається у клубок). Такого роду методи ізоляції протопластів називають механічними. Наприклад, якщо смужку епідермісу цибулі витримати у 0,5М розчині сахарози до явного плазмолізу, а потім розрізати його тонким лезом, то можна спостерігати вихід протопластів у середовище. Механічний метод виділення протопластів має незручності і недоліки, серед яких необхідно відмітити такі:

· Виділяється невелика кількість протопластів;

· Використовуються тільки ті тканини, в яких відбувається екстенсивний плазмоліз;

· Важко одержати протопласти з меристемних тканин;

· Протопласти зазнають сильного осмотичного шоку;

· Меттод довготривалий і трудомісткий.

Інший спосіб був запропонований англійським вченим Е.Кокінгом, який у 1969 році за допомогою спеціальних ферментів руйнував целюлозно-пектинову оболонку і одержував «голі» клітини – протопласти. Після вдалих робіт І. Такебе (1971) ензиматичний метод знайшов широке застосування при виділенні протопластів у багатьох лабораторіях світу. Переваги методу переконливі:

· Одночасно можна виділяти і працювати з великою кількістюпротопластів (10^{6 –} 10⁹⁾;

· Протопласти не зазнають сильного осматичного ущільнення, вони більш інтактні і непошкоджені;

· Метод відносно швидкий.

Для ізолювання протопластів використовують суміші різних ферментів, дія яких спрямована на гідролітичне розщеплення полісахаридних компонентів клітинних стінок. Ці ферменти мають відповідні назви – целюлази, геміцелюлази, пектинази.

Успішне виділення протопластів залежить від багатьох факторів: типу тканини (листок, корінь, калус, пилкові зерна, пелюстки тощо), виду і фізіологічного станурослини, складу фементів і їх концентрації, часу обробки тканин ферментами, вибору осматичного стабілізатора (глюкоза, сахароза, маніт, сорбіт), рН середовища і температури. Середовище повинно бути кислим (рН 5,4-6,2), а головне – трохи гіпертонічним (0,3-0,8 моль/л), щоб протопласти знаходились у невеликому стані плазмолізу (при таких умовах гальмується метаболізм і не відбувається швидка регенерація клітинної стінки). Крім того, таке середовище стримує тургор і не дозволяє клітинам лопатись. Використовують молоді листки рослин, ттому що в їх міжклітинній речовині переважно міститься пектин.

2. Протопласти – «голі» клітини – можуть зливатися і утворювати гібридний протопласт, який поступово «одягається» (будує свою клітинну стінку), ділиться і спроможний стати гібридною рослиною шляхом ембріоїдогенезу або органогенезу.

Соматична гібридизація(синонім – парасексуальна гібридизація) – гібридизація соматичних клітин шляхом злиття їх ізольованих протопластів (англ. Fusion of protoplasts).

Застосування методології злиття протопластів дозволяє соматично схрещувати філогенетично віддалені види рослин, а також створювати додаткові резерви спадкової мінливості. У нинішній час селекціонер мало зацікавлений у тому, щоб зробити дикі форми культурними. Для нього набагато важливіше передати від «дикуна» до культурної форми окремі гени, які можуть надати стійкості культурним рослинам до біотичних і абіотичних факторів довкілля.

Р.Г. Бутенко і А.А. Кучко (1977) одержали фертильний соматичний гібрид між диким і культурним видами Solanum chacoence та S. Tuberosum, який характеризується стійкістю до вірусу У. Цей гібрид застосовується у подальших селекційних схрещуваннях.

Для декоративного садівництва викликають інтерес соматичні гібриди Дж. Пауера між видами Petunia parodi і P. parvifolia, які статевим шляхом не схрещуються. Цим способом до селекції залучено нову ознаку «розгалужений пагін, що стелеться». Х. Шенх одержав соматичний гібрид між капустою і турнепсом (перко). Аналогічних прикладів можна навести дуже багато.

Методами парасексуальної гібридизації створені міжродові та міжтрибні гібриди. Особливий науковий інтерес викликають міжцарственні клітинні гібриди, які одержують шляхом злиття протопластів рослиннтх і тваринних клітин; наприклад , протопластів еретроцитівщура і дріжджових клітин, протопластів моркви і людини та ін. Одержати рослинно-тваринні «монстри» не вдається тому, що еволюційно закріплений консерватизм передачі спадкової інформації усуває негомологічні хромосоми у метафазі першого мейозу і подальше ділення неможливе.

Соматичні цибриди.Спадкова інформація рослинної кліттини зберігається в геномі (хромосомах ядра) і цитоплазмоні (ДНК хлоропластів і мітохондрій). Існують методи вилучення або інактивації ядра, що приводить до одержання протопластів без ядра – цитопластів. При злитті протопласті і цитопласта утворюється соматичний цибрид. Таким чином, генетична основа соматичного цибрида може складатися з елементів двох цитоплазмонів і одного із ядер батьківських протопластів. Саме тому метод соматичної гібридизації дозволяє одержувати такі форми рослин, що відрізняються сукупністю генів від статевих гібридів, а також створювати нові унікальні комбінації генів (цитоплазматичні гетерозиготи).

Наприклад, при злиттті протопластів мезофілу томатів і картоплі були одержані соматичні гібриди, які диференціювали за білковими маркерами на два типи: «помати» (з пластидами від картоплі) і «топати» (з пластидами від томатів).

Спеціалісти вважають, що у гібридів, які об’єднують елементи цитоплазми обох батьків і мають ядро одного з них, перспективне майбутнє. При злитті цитоплазмонів можуть відбуватися рекомбінації мітохондріальних або хлоропластних ДНК, які приводять до створення нових генотипів.

Після одержання соматичних гібридів або цибридів необхідно проводити біохімічний і цитологічний аналіз батьківських форм і гібридів першого покоління за спеціальними методиками (питання 4.).

3. Методи злиття протопластів.

Протопласти несуть негативний поверхневий заряд, що призводить до їх взаємного відштовхування. Тому для об’єднання проттопластів необхідно це відштовхування подолати або усунути.

Розроблені і практично виколристовуються два основних методи злиття – хімічний і електричний.

Хімічний метод передбачає обробку протопластів поліетеленгліколем (ПЕГ), а потім – буферним розчином з високим вмістом Са²⁺, рН 10,5. В інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України методику індукції злиття протопластів так і називають: «ПЕГ – високий рН – високий Са²⁺ (Момот В.П., Кучук М.В., Пастернак Т.П., 1988). Додавання ПЕГ до батьківських протопластів приводить до їх злипання в результаті дегідратації.

Поглинання вільної води призводить до утворення отворів по всій поверхні плазмалеми і відбувається перетікання внутрішньоклітинного матеріалу.

На початку 80-х років був розроблений метод електрозлиття протопластів (Ватс Д, Кинг Дж., 1984; Хан-Хагердал В., Борнман Х., 1986). Протопласти суспензують між двома електродами. При дії змінного струму проходить діелектрофорез і протопласти шикуються у ряд таким чином, що приєднуються своїми полярними поверхнями один до одного. Потім накладають сильний імпульс постійного струму (600в/см 10-20 мкс), який обумовлює утворення отворівв ущільнених мембранах. У місцях контактів протопластів утворюються містки, по яких відбувається перетікання цитоплазм у вигляді міжпротопластного обміну. Успіх культивування продуктів злиття протопластів залежить від їх здатності синьезувати нову оболонку, ділитися і давати початок регенерантам.

Природа злитття протопластів остаточно не з’ясована і активно вивчається.

4. Для підтвердження гібридної природи отриманих у результаті злиття клітинних агрегетівррослин-регенерантів необхідне проведення цитологічного, біохімічного і молекулярногенетичного аналізів.