Тема: Мутагенез та клітинна селекція.

1. Процес одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні;

2. Вихідні матеріали для клітинної селекції;

3. Мутагенез та відбір клітин за ознаками;

4. Науково-практичне значення робіт з клітинної селекції;

5. Кріозбереження рослинного матеріалу.

1. Селекція (від лат. selectio – вибір, відбір) – наука, яка досліджує і застосовує на практиці принципи і методи поліпшення існуючих та виведення нових сртів і гібридних форм рослин, необхідних для задоволення харчових, лікарських, естетичних та інших потреб людини.

Успіх у селекції рослин визначається наявністю стійкої генетичної мінливості у первинній або вихідній популяції. Якщо розглядати кожну клітину суспензійної популяції як індивідуальний організм, то перехід на клітинний рівень дозволяє селекціонеру мати справу з величезною кількістю особин. Дослідник в одному експеременті в умовах ін вітро використовує мільйони клітин (у порівнянні з сотнями-тисячами рослин при роботі селекціонера у полі).

Клітинна селекція – сукупність методів відбору клітинних ліній з новими успадкованими знаками в умовах ін вітро.

Щоб одержати клітинний штам, стійкий до певного фактора, суспензію клітин піддають мутагенній дії, а потім висівають на середовище з цим фактором, але у концентраціях, які пригнічують ріст нормальних клітин (клітин дикого типу). Можливо, що після мутагенезу на мільйон клітин зустрінеться одна з генетичними відхиленнями, які дозволять їй вижити у жорстких селективних умовах. Клітина формує калус, який, у свою чергу, дає початок рослині-регенеранту.

Таким чином, користуючись способом селекції мікроорганізмів, в умовах ін вітро на селективних середовищахвідбирають клітини з мутантними генотипами, а потім одержують з них рослини, що стійкі до конкретного селективного фактора. Такий шлях селекції дозволяє відносно швидко одержувати нові форми рослин.

Оснвні етапи одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні:

1. Відбір об’єкту для мутагенезу – калусні, суспензійні культури, ізольовані протопласти;

2. Обробка об’єкту мутагеном (фізичні фактори – температура, опромінювання, хімічні речовини та ін.;

3. Інкубація клітин на рідкому поживному середовищі у неселективних умовах;

4. Перенесення суспензії у селектиивні умови (засолення, токсини, гербіциди, понижені або високі температури, метали та ін.);

5. Виділення життєздатних колоній, які вижили в жорстких селективних умовах;

6. Відбір змінених, стійких до селективного фактора клонів;

7. Індукція органогенезу або ембріоїдогенезу;

8. Одержання змінених рослин-регенерантів, які відрізняються в порівняні з материнськими рослинами;

9. Висадка рослин у грунт, вивчення генетичної природи стійкості, тестування на стійкість.

2. Об’єктом для мутагенезу і селекції можуть бути калусні, суспензійні культури або ізольовані протопласти. Вибір об’єкту залежить від наявності розробленої технології стосовно до конкретної культури, а також від кінцевої мети дослідження.

Калусна тканина – доступний матеріал, який відносно легко одержують у лабораторних умовах. Використовують свіжовиділену калусну тканину, що не втратила регенераційної здатності (тема: «регенерація рослин шляхом соматичного ембріоїдогенезу»). Відбір мутантів за допомогою калусних тканин часто використовують при селекції ліній, (стійких до фітозахворювань) і стресових факторів (Левенко Б.О., 1991).

Клітинна суспензія – це поодинокі клітини або клітинні агрегати, які вирощують на рідкому поживному середовищі в умовах постійної аерації. Аерація об’єктів забезпечується такими способами:

· Культурою клітин, які занурені у рідке поживне на качалках ротаційного або шейкерного типу (накопичувальне культивування);

· Вирощуванням шматків калусуна містках-підтримках з фільтрувального паперу.

Більшість суспензійних культур одержують шляхом перенесення шматочків пухкої калусної тканини на рідке поживне середовище, яке постійно перемішується. Швидкість обертання кругової качалки повинна бути у межах 30-150 об/хв з амплітудою обертання 2-4 см. Через певний проміжок часу процес зупиняють; системі дають відстоятись і піпеткою (шприцем) відбираютьверхній шар суспензійної культури клітин. Для вилучення великих за розміром агрегатів клітин існує спосіб фільтрування культури крізь найлонове сито. В процесі субкультивування клітини проходять наступні послідовні фази:

1. – латентну або лаг-фазу;

2. – експотенціальну (логарифмічну) фазу;

3. – лінійну фазу;

4. – стаціонарну фазу;

5. – фазу загибелі клітини.

Накопичувальні суспензії, як правило, культивують до стаціонарної фази росту, що у більшості випадків складає тривалість пасажу 21-28 днів. Після нанесеня суспензії на сітку Горяєва або Фукса-Розенталя клітини підраховують.

Широкі можливості для клітинної селекції відкривають технології ізольованих протопластів (тема: «одержання та культивування протопластів»). У великих однорідних популяціях гаплоїдних або диплоїдних протопластів проводять кількісні дослідження мутагенезу соматичних клітин, аналізують експресію індукованих фенотипових змін на клітинному і організменому рівні.

Основними вимогами, що ставляться до модельних об’єктів у клітинній селекції є:

· швидкий ріст у культурі ін вітро,

· збереження регенераційної здатності,

· невелика кількість хромосом,

· наявність високоефективної методики виділення і культивування протопластів, клітин,

· існування справжніх гаплоїдів,

· короткий життєвий цикл рослин (Сидоров В.А.,1990).

3. Спадкова передача ознак від батьківських клітин своїм нащадкам – процес консервативний, але ця консервативність не є абсолютною. У деяких випадках мають місце помилки, в результаті чого структура хромосом або послідовність нуклеотидів ДНК дочірних клітин стає іншою. Ці раптові зміни спадкового матеріалу називають мутаціями. Клітини або організми, які є носіями змінених генів і відрізняються від вихідного (дикого) типу, називають мутантами. Мутації можуть стосуватись як ядерних генів, так і їх цитоплазматичних структур, що несуть у собі ДНК (мітохондрії, хлоропласти).

Розрізняють такі типи мутацій:

1. Генні, або точкові, мутації – спадкові зміни гена, які найчастіше відбуваються в одному з двох алельних локусів пари гомологічних хромосом. Мутантні гени є переважно рецесивними.

2. Хромосомні мутації – одна або декілька хромосом виявляють структурні зміни, що викликано розривами та перебудовами хромосомного матеріалу.

3. Геномні мутації обумовлені змінами числа хромосом в хромосомних наборах (геномах) або ж змінамикількості хромосомних наборів у мутованих клітинах. Геномні мутації, як правило, викликають явище поліплоїдії (кратне збільшення числа хромосом).

4. Плазмонні мутації виникають внаслідок можливих мутацій позахромосомних спадкових структур клітини, окрім локалізованих у пластидах.

5. Пластидні мутації характеризуються змінами пластид хлорофільних зерен (білоплямистість, строкатолистість у зелених рослин)

Мутагенез –процес виникнення мутацій під впливом ріхних фізичних і хімічних мутагенних факторів.

Серед хімічних супермутагенів ін вітро використовують два класи речовин: клас НАК (нітрозоалкілсечовин) і ДАК (діазокетонів). Найбільш поширені супермутагени:

· етилметансульфонат (ЕМС);

· диметилсульфонат (ДМС);

· метилметансульфонат (ММС);

· етиленмін (ЕМ) та ін.

Розчини мутагенів готують, як правило, на середовищі для культивування і додають до суспензії клітин. Через певний час клітини промивають середовищем від мутагенів і ресуспензують у свіжому середовищі. Після 4-7 днів інкубаційного росту клітини знову промивають і ресуспензують до необхідної щільності. Спектр дії хімічних супермутагенів дуже широкий – від генних мутацій до різноманітних хромосомних перебудов.

Поряд з хімічними мутагенами в експерементах з культурами клітин широко використовують іонізуюче (рентгенівське, гама-промені) і ультрафіолетове випромінювання. Найбільш широкий спектр мутацій спостерігається при використанні іонізуючого випромінювання. При рентгенівському опроміненні клітин вченими одержані пігментдефектні лінії дурману і петунії, хлорстійкі лінії тютюну.

Загальна методологія відбору мутантів ін вітро складається з таких етапів:

1. Селекція необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні.

2. Регенерація з клітин рослин.

3. Експресія мутаційних змін на рівні цілих рослин-регенерантів.

Вибір часу для проведення селекції залежить від кількості клітин у вихідних колоніях, типу мутацій, стадії клітинного циклу, числа поділів мутантних клітин до початку селекції.

Способи відбору необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні можна класифікувати так:

· Пряма (позитивна) селекція, при якій виживає лише певний мутантний тип клітин;

· Непряма (негативна) селекція. Грунтується на вибірковій загибелі клітин дикого типу та виживанні метаболічно неактивних клітин, які потребують додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;

· Візуальна селекція та неселективний відбір, коли ідентифікація лінії серед всієї популяції клітин відбувається візуально або за допомогою біохімічних методів;

· Тотальна селекція, яка передбачає індивідуальне тестування всіх клітинних клонів.

Пряма селекція – є найбільш поширений метод виділення мутантів стійких до антибіотиків, гербіцидів, токсинів та ін. антиметаболітів.

4. Клітинна селекція – процес зростаючого домінування в культурі клітин певного типу, який цікавить дослідника. Це відкриває широкі можливості клітинної селекції при вирішенні багатьох теоретичних і практичних питань біологічної і сільськогосподарської науки. Наприклад, якщо шляхом мутагенезу і селекції відібрати клітину, стійку до засолення або гербіциду, то і одержана з неї рослина-регенерант також повина бути стійка до цього фактора.

За допомогою методів клітинної селекції вже одержано багато біологічних об’єктів, серед яких:

· Картопля, яка стійка до кільцевої гнилі;

· Стійкі до механічного збирання томати;

· Цукрова тростина із стійкістю до склероспоріозу, борошнистої роси та підвищеним вмістом цукру;

· Калус пшениці, який витримує температуру - 40ºC (перспективний напрямок робіт з зимостійкості злакових).

На сьогодні більшість експерементів проводяться на модельних об’єктах. Проте саме їх використання дозволяє розрробити тонкі методи селекції різних різних мутантів, визначити можливості клітинної селекції при створенні нових біотехнологій у таких напрямках:

- одержання та вивчення хлорофілдефектних мутантів;

- маркірування сільськогосподарських культур і використання їх у подальших генетично-селекційних дослідженнях;

- одержання більш збалансованого амінокислотного складу білка зернових культур;

- регуляція метаболічних шляхів РНК і ДНК в клітинах;

- використання спецефічних інгібіторів процесів фотодихання і біосинтезу поліамінів як селективних факторів при клітинній селекції;

- селекція мутантів, стійких до дії гербіцидів, засолення, посухи, радіації, екстремальних температур і патотоксинів;

Підводячи деякі підсумки, можна стверджувати, що одержання нових генотипів шляхом клітинної селекції – реальність, яка потребує подальшого вивчення і більш широкого застосування на практиці.

5. Кріобіологія (від грецьк. kryos – холод, мороз, лід) – розділ біології, який вивчає дію на живі системи низьких та наднизьких температур (від 0 ºC до абсолютного нуля). Кріостійкість клітин, тканин і органів рослин, їх природний та штучний захист від кріопошкоджень стає актуальною проблемою з теоретичної і практичної точки зору. Це пов’язано з необхідністю збереження генофонду елітних, рідкісних і зникаючих рослин, а також клітинних штамів-продуцентів, які складають основу біотехнологічних виробництв лікарських, харчових та біологічно активних речовин.

Термін «кріозбереження» (анг. cryopreservation) застосовується для позначення складного багатоетапного процесу, метою якого є обмежено тривале зберігання життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані холодового анабіозу. Єдиним надійним засобом для вирішення цієї проблеми є глибокий холод (нижче - 140ºС), який забезпечує використання рідкого азоту (- 196 ºС) або його парів (- 150ºС). Позитивність глибокого заморожування полягає в тому, що при температурах, близьких до - 196 ºС, фактично повністю зупиняються процеси метаболізму клітин і тим самим зберігається їх генетична і епігенетична характеристика. Це дозволяє зберігати і потенційно використати навіть через сотні роківнеобхідний генотип, який буде знаходитись у кріогенному банку рослин.

Кріозбереження як система єдиного екстремального процесу (заморожування –зберігання – розморожування) складається з таких етапів:

- підготовка об’єкту,

- додавання кріопротектора,

- заморожування в певному режимі,

- зберігання в рідкому азоті,

- розморожування,

- видалення кріопротекторів (відмивка),

- рекультивація (для клітин),

- регенерація цілих рослин.

Найбільш відповідальним етапом кріозбереження вважається процедура заморожування. Цей процес відносно простий для об’єктів здуже низьким вмістом води (пилок, насіння), які можна безпосередньо занурювати у рідкий азот і проводити розморожування на повітрі у звичайних умовах. Труднощі виникають при заморожуванні тканин або органів рослин великого розміру. Збереження життєздатності об’єктів за рахунок зниження фази рідкої води забезпечується програмним заморожуванням у присутності кріопротекторів з постійною малою швидкістю (0,3 – 1 град/хв) до - 40 ºС. Присутність кріопротекторів дозволяє вільній воді вийти з клітин і кристалізуватись вже на поверхні у розчині.

Кріопротектори – це речовини, які зв’язують вільну воду як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих зв’язків; зменшують ущільнення протопластів клітин при заморожуванні. Використовують різноманітні речовини-кріопротектори: диметилсульфоксид(ДМСО), поліетиленгліколь(ПЕГ), поліетиленоксид, етеленгліколь, гліцерин, сахарозу, сорбіт, маніт, лактозу та ін.

На сьогодні успішне кріозбереження клітинних і тканинних культур ін вітро здійснено майже для 70 видів рослин, половина з яких – меристеми. Вченими вже одержані рослини-регенеранти картоплі, моркви, гороху, суниць, томатів з меристем, які зберігались при наднизьких температурах. Активно проводяться дослідження з кріозбереження клітинних штамів-продуцентів економічно важливих речовин. Таким чином, захист і збереження рослинних ресурсів являє собою гідну задачу для біотехнології.