Тема: Біотехнологічні методи одержання безвірусного садивного матеріалу.

1. Віруси рослин: структура, циркуляція у природі;

2. Одержання безвірусних рослин ін вітро;

3. Поєднанння методу верхівочних меристем із термотерапією;

4. Хіміотерапія при оздоровленні рослин від вірусів

5. Діагностика рослин на наявність вірусів.

1. Віруси – неклітинні форми життя, які мають власний геном (молекулу ДНК або РНК) і здатні до відтворення лише в живих клітинах хазяїна (рослини, тварини, бактерії), тобто є паразитами на генетичному рівні.

Залежно від виду нуклеїнової кислоти розрізняють ДНК- і РНК-вмісні віруси, які зверху оточені білковою оболонкою – капсидом. Переважна більшість фітовірусів РНК-вмісні.

Віруси позбавлені багатьох ознак, притаманих всім живим істотам: у них відсутні спеціальні пристосування для самостійної циркуляції в природі, вони не можуть репродукуватись в ізольованому вигляді і у них відсутні енергетичні системи.

У 1966 році на Міжнародному мікробіологічному конгресі було вирішено виділити віруси в окреме самостійне царство – Vira.Віруси діляться на 30 таксономічних груп. Поза клітиною-хазяїна вірус перебуває в нереплікованому стані (стані віріону). Діаметр віріонів становить 20-300 нм, що значно менше за найменших прокаріот.

Віруси потрапляють у клітину найчастіше за допомогою комах або в результаті механічного пошкодження тканин рослини. Нуклеїнова кислота вірусу залишає білкову оболонку і стає активною: реплікується і транслюється у вірусні нуклеїнові кислоти і білки, з яких самозбираються нові віруси. Дочірні віруси виходять з клітини-хазяїна, яка гине. У природі їх розповсюдження забезпечується різними способами: через насіння, корені, бульби, цибулини, пилок, через грунт, рештки хворих рослин, воду, комах-перенощиків або зооспор деяких нижчих грибів. Найчастіше саме людина сприяє розповсюдженню вірусів при щепленні, підрізуванні, пасинкуванні або пікіровці рослин.

Відмічається, що найбільше вірусів міститься у нестиглому насінні, а у стиглому вони поступово інактивуються, що пояснюється переходом насіння до стану спокою і накопичення інгібіторів, які пригнічуютьактивність вірусу (Московець С.М. 1971). Ураження відбувається шляхом повільного транспорту вірусів по рослині. Саме факт повільного переміщення вірусів забезпечує їх відсутність у новостворених меристематичних тканинах, які вилучається і використовуються у практиці для мікроклонального розмноження рослин.

Вірусні захворення різко знижують кількість і якість урожаю різних сільськогосподарських рослин. Наприклад, збитки від вірусу жовтої карликовості складають до 40% урожаю ячменю. Вірусна хвороба цукрового буряка (ризоманія) знижує вдвічі урожай і на 5-6% - цукристість солодких коренів.

На сьогодні відомо понад 400 фітовірусів і ще більше вірусних захворювань у різних рослин. Класифікують захворювання на дві великі групи: мозаїки і жовтухи. Основна симптоматика мозаїк – нерівномірне (мозаїчне) забарвлення листків, яке обумовлене порушеннями пластидного апарату клітин; листки часто бувають зморшкуватими. Характерні ознаки жовтух – загальний хлороз листків, які мають жовтуватий відтінок і скручуються. Листя надзвичайно насичується вуглеводами, що приводить до їх підвищеної жорсткості і крихкості.

На практиці основними засобами з вірусними захворюваннями є: виведення стійких та імунних сортівс.г. культур, знищення комах, бур’янів, хворих рослин, регулювання строків посіву та збирання с.г. рослин,фізичні та хімічні засоби обробки насіннєвого та садивного матеріалу, вакцинація та ін.

2. Особливі перспективи для оздоровлення рослинного матеріалу від вірусних захворювань відкриває метод культивування верхівочних меристем ін вітро у поєднанні з методами термо- і хіміотерапії.

Перші дослідники, які працювали з культурою ізольованих тканин і органів рослин, проводили експеременти чисто фізіологічного напрямку. У 1934 році один із засновників цього методу П.Уайт (США) повідомив, що віруси відсутні у кінцівках коренів рослин, уражених вірусом тютюнової мозаїки. Подібні результати були одержані у 1949 році в дослідах М.Корнюа і П.Лімансе. Відсутність вірусів в апексах розміром 0,1 мм складає основу методу одержання оздоровлених (безвірусних) рослин з меристем ін вітро, який запропонували Ж.Морель і К.Мартен. У 1952 році вони одержали безвірусні жоржини від уражених рослин.

Чому віруси відсутні у верхівочних меристемах?

Найбільш сприятливими органами для репродукції вірусів є тканини листків. У вірусів відсутні більш будь-які спеціальні пристосування для самостійного (автономного) пересування по рослині, тому можна передбачити симпластичний або апопластичний шлях їх міграції по сформованих тканинах і органах. Відомо, що обмін речовин і органічний зв’язок між клітинами здійснюється крізь пори, які мають власні, дуже маленькі отвори, крізь які проходять тяжі цитоплазми – плазмодесми. Завдяки плазмодесмам з’єднуються в єдине ціле цитоплазмиусіх живих клітин і утворюється так званий симпласт.

Мікроскопічні дослідження свідчать, що клітини верхівкової меристеми у період активного поділу дрібні, з тонкою целюлозною оболонкою ізодіаметричної форми. Вони щільно зімкнені між собою, не мають міжклітинників.

Отже існують такі спостереження:

· Віруси повільно розповсюджуються по рослині;

· Клітини меристем швидко діляться;

· Серед клітин верхівочних меристем відсутні міжклітинники, недостатньо налагоджена система плазмодесм, що ускладнює апопластний і симпластний шлях переміщення вірусу.

Таким чином, є всі підстави зробити припущення, що анатомо-фізіологічні особливості верхівочних меристематичних клітин роблять неможливим надходження до них вірусів. Вірус не встигає за швидким утворенням перших груп меристематичних клітин у верхівці розміром близько 0,075-0,1 мм. Розмір меристем визначає поріг концентрації вірусних частинок.

Як правило, для ефективного звільнення від вірусів використовують шматочки меристем розміром 0,10-0,15 мм. Проте чим меншаза розміром меристема, тим складніше вона приживається на поживному середовищі і регенерується у цілу рослину. Метод мікроклонального оздоровлення стає більш надійним і ефективним при додатковій термообробці і хіміотерапії рослин.

3. Окремі фізичні і хімічні фактори мають стимулюючу або пригнічуючу дію на віруси, а також на рослини, у яких вони репродукуються. До цих факторів належать температура, різні види випромінювання, постійне магнітне поле, рН середовища, деякі хімічні речовини.

Термотерапія рослин (дія високих температур) – один із ефективних методів профілактики і лікування вірусних захворювань. Піонером застосування термотерапії для лікування рослин вважають П.Кобуса, який у 1889 році використовував гарячу воду проти вірусного захворювання цукрової тростини. Новий етап у розвитку термотерапії почався у 1935 році, коли американець Л.Кункель застосував гаряче повітря для лікування персика від жовтухи, дрібноплодності і розеточні.

Різні методики оздоровлення рослин від вірусів методом термотерапії передбачають інактивацію вірусної інфекції – температурами 30-50ºC, які протягом певного періоду експозиції не завдають шкоди фізіології самої рослини. Цей метод дозволяє брати для оздоровлення більші за розміром меристеми, які набагато краще виживають на поживних середовищах ін вітро (0,3-0,8 мм). Застосування методу особливо ефективне при отриманні безвірусних рослин, які вегетативно розмножуються (картоплі, яблуні, кісточкових, винограду, хмелю, суниці, малини, квітів та ін.)

Широке впровадження в сільськогосподарську практику безвірусного садивного матеріалу картоплі стало можливем саме завдяки поєднанню методів верхівочних меристем і термотерапії. Ця технологія складається з таких етапів:

1.Термічна обробка матеріалу (бульб або укорінених верхівок)

2.Виділення верхівочних меристем і регенерація з них рослин

3.Індукція столоно- і бульбоутворення. Одержання мікробульб картоплі ін вітро.

Детальна технологія та схема одержання безвірусного матеріалу рослин картоплі розглядається на лабораторному занятті. Застосування цього методу дозволяє за 3-4 місяці одержати 2-3 тис. рослин придатних для висадки у грунт, тобто близько 20 тис. мікробульб за 9-10 місяців з однієї рослини. Це має велике значення для елітного насінництва. В Інституті картоплярства УААН цим методом оздоровлено понад 70 сортів картоплі. Одержаний таким чином матеріал розмножують протягом двох років у польових умовах, що дає можливість на третій рік мати достатню кількість елітного насінного матеріалу. На експерементальній базі Ігституту картоплярства одночасно розмножують 30 тис. рослин ін вітро і одержують три вррожаї на рік ( це становить близько 100 тис. мікробульб). Розроблений метод скорочує строки розмноження картоплі з 10 до 3-х років.

4. Метод хіміотерапії базується на обробці рослин речовинами –ігібіторами вірусів або на їх додаванні до поживного середовища ін вітро. Вчені вишукують антивірусні препарати, які виробляються самими рослинами. Позитивні результати одержані в цьому напрямку при використані екстрактів лаванди, ромашки, шавлії та ін. лікарських рослин.

Відома антивірусна дія антибіотиків. Іманін– антибіотик, вилучений із звіробою , сприяє підвищенню стійкості томатів до деяких вірусних захворювань. Комплексне передсадивне застосування тіосечовини і гіберелінівдля обробки бульбкартоплі сприяє зниженню продукції Х і Y- вірусів у рослин.

Велике значення має рН середовищепри самореплікації вірусу. У дослідах на картоплі встановлено, що при значеннях рН близько 10 відбувається дезагрегація вірусів і втрата їх активності.

Метод верхівочних меристем і хіміотерапія успішно доповнюють один одного при використанні панкреотичної РНК-ази, яку додають до поживного середовища. Відсоток здорових рослин-регенерантів на середовищі з РНК-азою у 1,5-2 рази вищий, ніж без неї. Щоб збільшити частку безвірусних меристемних рослин, до поживного середовища часто додають препарат «вірозол» (синтетичний рибоварин).

Існують інші методи одержання безвірусного рослинного матеріалу. Наприклад, метод мікрощеплення, який застосовують при умові, що насіння цитрусових, персика і багатьох плодових культур не передає віруси і залишається здоровим. Рослини, які виросли у пробірці ін вітро з насіння, готують під бінокулярним мікроскопом для мікрощеплення – рослину зрізують, а на кінці залишка стебла рроблять надріз, із яким щеплюють необхідний меристематичний експлант.

5. Найважливіша перевага мікророзмноження – одержання величезної кількості ррослин – може перетворитись у дуже небезпечний недолік, якщо матеріал не буде перевірений на чистосортність і відсутність вірусів.

Незбалансованого живлення або надмірної кількості мінеральних добрив, тощо. Крім того вірус може знаходитись у рослині в прихованому (латентному) стані і зовнішні ознаки не виявляються.

Фізичні і біологічні особливості вірусівпотребують специфічних методів їх діагностики. Сучасний стан досліджень передбачає використання таких методів діагностики на наявність у них вірусів:

· Метод електронної мікроскопії;

· Індикаторний (біологічний) метод;

· Метод імунодіагностики (імуноферментний аналіз).

Більш детально ці питання розглядаються призахисті модуля та підготовки студентами рефератів.