Тема: Регенерація рослин шляхом соматичного ембріогенезу

1. Явище соматичного ембріоїдогенезу та його види;

2. Загальні принципи одержання калусної тканини;

3. Технологія вирощування рослин-регенерантів шляхом соматичного ембріоїдогенезу;

4. Природа сомаклональної мінливості;

5. Методи ідентифікації сомаклонів та практичне використання і перспективи сомаклональної мінливості.

1. Явище соматичного ембріоїдогенезу характеризується утворенням зарадкоподібних структур (ембріоїдів) нестатевим шляхом із соматичних клітин рослин. Розрізняють прямий і непрямий шляхи соматичного ембріоїдогенезу.

Прямий соматичний ембріоїдогенез – це процес формування вегетативного зародка з тканин експланта без проміжної стадії утворення калусної тканини. Такі зародки в природних умовах розвиваються за рахунок клітин нуцелуса, а інколи й покривів (без будь-якого зв’язку із зародковим мішком) і носять характер додаткової (адвентивної) ембріонії. Такий вид апоміксису (аспорія) зустрічається у мандарина, лимона, апельсина і зумовлює багаттозачатковість (поліембріонію), внаслідок чого утворюється до 20 зародків, але нормально розвивається 1-4, решта – відмирають. Це явище використовується в умовах ін вітро: нуцелус незрілих плодів лимонузвільняють від інтегументів і висаджують халазною частиною на агаризоване поживне середовище. Соматичні зародки утворюються безпосередньо з клітин нуцелуса, що культивуються.

Методи ефективного одержання зарадкоподібних структур шляхом прямого соматичного ембріоїдогенезу знаходяться у стані пошуку.

Непрямий соматичний ембріоїдогенез передбачає утворення ембріоїдів з клітин калусної тканини і складається з таких етапів:

1. введення експланта в культуру ін вітро;

2. стимуляція росту калуса і формування презародків;

3. індукція формування біполярних зародків з презародків.

Індукція соматичних ембріоїдів вже одержана в культурах клітин і тканин близько 140 видів рослин.

2. Калус («калюс»), від лат. calus – мозоль – це особливий тип тканини рослин, яка утворюється на місці поранення і сприяє заживанню. Тканина закриває місце поранення і накопичує поживні речовини, необхідні для регенерації спеціального захисного шару. В калусній тканині можуть утворюватисьзачатки органів, що доповнюють або відновлюють цілісність організму.

Калусні клітини – це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах ін вітро. Калусна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхимних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калусу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК; деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму. Колір тканин може бути білим, жовтим, зеленкуватим, червонуватим, що залежить від виду рослини, типу експланта, умов культивування.

Калусні клітини можна невизначено довго вирощувати ін вітро. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3-4 тижні. Найбільш «старим» вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре ще у 1938 році і який по сьогоднішній день вирощують у багатьох лабораторіях світу.

Для індукції калусоутворення стерильні експланти (листки, черешки, сегменти стебел, корінців тощо) нарізують і поміщують на поживне середовище з високим значенням співвідношення ауксин/цитокінін: ауксину в середовищі повинно бути у 5-10 разів більше, ніж цитокініну. Наприклад, концентрація 2.4 Д (1-3 мг/л), а БАП (0,1-0,5 мг/л). Експлант трохи вдавлюють в агар для забезпечення надійного контакту. Кінчики коренів легко утворюютть калус при їх горизонтальному розміщенні в агарі, тоді як сегменти листка – при вертикальному. Пробірки, склянки або чашки Петрі витримують у темноті при 25ºC (інколи вирощують на світлі). У перші 4-5 днівспостерігається розтягування клітин і збільшення розмірів експланта, а потім, за рахунок інтенсивних мітотичних ділень, починає утворюватись калусна тканина.

Перехід спеціалізованих клітин у стан неорганізованого росту пов’язаний із синтезом білка в клітинах, збільшенням вмісту РНК, зникненням хлоропластів і хромопластів. При оптимально підібраному середовищі сегменти утворюють калус через 3-8 тижнів.

3. Тотипотентність дедиференційованих калусних клітин обумовлює їх здатність в певних умовах повертатись до ембріонального стану і давати початок рослинам-регенерантам. Таке перетворення відбувається після перенесення невеличких частин калусних тканин на середовище з рівним співвідношенням ауксин/цитокінін, а потім - на середовище без фітогормонів. Відпрацювання методики одержання ембріогенного калусу та індукції ембріоїдів обов’зково передбачає підбір середовища і вибір експланта для конкретного виду або сорту рослин. Крім того, перші пасажі калусних культур мають більш високий морфогенетичний потенціал, який поступово втрачається при тривалому культивуванні.

Електронномікроскопічні спостереження за процесом формування ембріоїдоподібних структур на калусній масі свідчать, що спершу з’являються бугорчасті утворення, подібні до апексів. Як правило, ембріоїди проходять три стадії розвитку: глобулярну, серцевидну і торпедовидну.

Соматичні ембріоїди легко відокремлюються від калусної маси і пересаджуються на інше поживне середовище для одержання з них рослин-регенерантів. Ембріоїди виникають з поверхневих клітин і мають одноклітинне походження. Ембріогенні клітини відрізняються більш щільною цитоплазмою, відносно великим ядром і значною кількістю рибосом. Відмічають також, що перетворення калусної клітини в ембріогенну супроводжується перерозподілом у неї мікротрубочок: хаотичне розміщення мікротрубочок змінюється на їх лінійну орієнтацію паралельно вісі клітини.

Таким чином, походження зарадкоподібних структур серед клітин калусної тканини не пов’язане з мейозом та подвійним заплідненням.

4. Рослини-регенеранти, які одержані шляхом соматичного ембріоїдогенезу, називають сомаклонами (синонім– сомаклональними варіантами). У 1981 році Р.Чалеф запропонував символ Rдля рослин-регенерантів, одержаних з культур клітин або тканин. Самозапилені нащадки рослини R₀ позначаються R₁; наступні покоління від самозапилення – R_2, R₃ і т.д. Це пояснюється необхідністю прийняття універсальної номенклатури для регенерантів і проведення генетичного аналізу їх нащадків. Поява сомаклонів, що мають генетичні відмінності від материнської рослини, обумовленна існуванням сомаклональної мінливості.Це явище було відкрите на початку 80-х років і вважається одним із перспективних напрямків індукції мінливості в культурі ін вітро. Невизначеність генотипів ембріоїдів, з яких утворюються сомаклональні варіанти, обумовлює їх потенційну цінність для поліпшення існуючих сортів рослин.

Природа виникнення сомаклональної мінливості пояснюється двома основними причинами:

· генетична гетерогенність соматичних клітин експланта вихідної рослини;

· генетична і епігенетична мінливість, що індукується умовами культивування.

Перша причина пов’язана генетичним різноманіттям соматичних клітин у природі (різний рівень плоїдності, химеризм). В клітинах меристемних тканин рослин на різних етапах онтогенезу може відбуватися ендореплікація хромосом і формування тканин з різним рівним плоїдності. Міксоплоїдія і химеризм особливо часто зустрічаються в апоміктичних і вегетативно розмножених рослин. Химерні тканини складаються з генетично неоднорідних клітин, які можуть різнитися ядерними генами, числом хромосом. Генами пластид або мітохондрій.

Існує класифікація типів химерних тканин рослин:

1. Мозаїчні (гіперхемерні) – генетично різні тканини утворюють мозаїчну структуру.

2. Секторіальні –різнорідні тканини розташовані окремими великими ділянками.

3. Периклинальні – танини, розташовані одна над одною.

4. Мериклинальні – суміш сектроріальних і периклинальних ділянок тканин.

Прикладами химеризму можуть служити характер забарвлення, строкатолистість пеларгонії і хлорофітуму, що обумовлено різним числом шарів меристем точки росту, які приймають участь в утворенні листка.

Химеризм, міксоплоїдія, спонтанні поліплоїди виникають в результаті природних або штучних мутацій, а вегетативне розмноження зберігає набуті зміни в рослинах-регенерантах. Хромосомні перебудови спостерігаються також при зміні умов вирощування (підвищенні або пониженні температури, високі дози мінеральних добрив, засолення, поранення, пестициди та ін.), які приводять до фізіологічних порушень і аномальних мітозів.

Багато клонів винограду, які створені прородою шляхом брунькових мутацій з одного сорта-засновника, відібрані і виділені людиною в окремі високоякісні сорти (наприклад, Шасла біла, Шасла мускатна, Шасла рожева та ін.). У картоплі теж може відбуватися накопичення соматичних мутацій, а індукція ін віво або ін вітро адвентивних пагонів дозволяє одержати нові форми рослин.

Висновок: 1. таким чином генетична гетерогенність соматичних клітин експланту материнської рослиниє однією з причин сомаклональної мінливості і обгрунтовує ймовірність виникнення нових генотипів сомаклонів. Вирішальну роль у регуляції цих процесів в умовах ін вітро відіграють фітогормони поживного середовища.

2. Порушення фітогормонального балансу (ауксин/цитокінін) впливає на тип морфогенезу, змінює мітотичний процес і призводить до змін у хромосомах ядра, виникнення сомаклональних варіантів ін вітро підтверджують фізіологічну гіпотезу мутаційного процесу, яка ще у 1946 році була запропонована М.Лобашевим, а сьогодні символізує сучасний період вивчення природи мутацій. Різні фізичні і хімічні фактори (температура. Випромінювання, дисбаланс регуляторів росту, хімічні агенти, тощо) спочатку викликають фізіологічні зміни в клітинах (порушення мітозу, мейозу, типу морфогенезу), що приводить клітини до передмутаційного стану.

Частота виникнення сомаклональних варіантів не перебільшує 4-6%. З метою збільшення частоти і розширення спектру сомаклональної мінливості використовують мутагени (нітрозометилсечовину, 1,4-біс-діазоацетилбутан та ін.).

5. Актуальність впроводження об’єктивних методів ідентифікації сомаклонів обумовлена широким спектором фенотипових і генетичних змін у рослин-регенерантів багатьох видів рослин. В практиці найбільш поширені такі методи ідентифікації: морфологічний, цитогенетичний, метод білкових маркерів і вивчення фрагментів ДНК.

Морфологічний методбазується на ідентифікації сомаклонів за зовнішніми (морфологічними) ознаками: висота рослини, розмір, форма і колір листків, квітів, плодів, насіння, фертильність, урожайність, стійкість до хвороб та ін.

Цитологічний аналізпередбачає вивчення числа і морфології хромосом сомаклонів, що дозволяє одержати найбільш переконливі і предметні докази поліплоїдності або міксоплоїдності рослин-регенерантів. Для цитогенетичних досліджень використовують тиснуті препарати з молодих корінчиків рослин або пророслого насіння довжиною 1-2 см. При цьому слід врахувати періодичність мітозів і проводити фіксацію матеріалу з певними інтервалами, щоб «вловити» пік мітотичного ділення. Аналізують також калусні тканини в період їх активного поділу, клітини суспензійної культури, протопласти.

Методи білкових маркерівбазуються на генетичній обумовленності синтезу білків (ферментів), що дозволяє використовувати їх як специфічні індикатори генотипу.

Електроферетичні варіанти білків та ізоферменти – це маркери, за якими тестують належність рослин до виду, біотипу, сорту; встановлюють ступінь спорідненості рослин; виявляють генетичну гетерогенність морфологічно однорідних популяцій. У деяких випадках з допомогою ізоферментів вдається виявляти деякі мутації на молекулярному рівні.

Аналіз ДНКшляхом рестрикції і гібридизації широко використовують для виявлення і вивчення організації послідовностей ДНК після їх електрофоретичного розділення. Аналіз специфічних нуклеотидних послідовностей, їх консервативних повторів, які гомологічні певному ДНК-зонду, допомагає «ловити» генетичні перебудови у сомаклонів.

За деякими характеристиками (велике число копій на геном, тандемна організація, видоспецифічність спейсерних послідовностей) гени рибосомальної РНК є найбільш зручними маркерамигеномів. Клонування таких послідовностей найчастіше застосовується як ДНК-зонди.

Сомаклональна мінливість - це джерело формоутворення і сортополіпшення важливих сільськогосподарських, декоративних, лікарських і технічних культур. На початку 70-х років нашого століття вперше із культури клітин цукрової тростиниодержані сомаклони, які різнились за морфологічними ознаками, цитологічними характеристиками та ізоферментними спектрами. На сьогодні важко назвати сільськогосподарську культуру, від якої ще не одержані сомаклональні варіанти або не проводяться роботи в цьому напрямку.

Таким чином, перспектива використання сомаклонів оптимістична, тому що вони у ряді випадків переважають вихідний сорт за цінними господарчими ознаками. Наприклад, у культурі солодкої картоплі був знайдений клон із однією новою комерційною ознакою – бульби мале більш темне і стабільне забарвлення. Рослини-регенеранти з цього клону дали початок новому сорту картоплі Скарлет.

Одержання рослин шляхом соматичного ембріоїдогенезу є складним циклічним процесом формування і культивування ембріоїдів на штучних поживних середовищах з наступною адаптацією рослин у грунті. Для захисту біологічного матеріалу і полегшення маніпуляції при роботі з ним вчені констроюють так зване штучне насіння – капсульовані соматичні ембріоїди. Вже розроблені перші методики одержання штучного насіння для моркви, люцерни, селери та інших культур.

Методика складається з таких етапів:

1. Індукція і одержання соматичних ембріоїдів.

2. Капсулювання соматичних ембріоїдів у гідрогелеві кульки альгінату кальцію.

Кожна капсула містить 2-3 ембріоїда, а також поживні і біологічно активні речовини. Спроби одержання рослин із капсульованих соматичних ембріоїдів у грунті потребують розробки поверхневих плівок, які утримують воду і забезпечують стерильність всередині капсули. Проводяться дослідження на додавання до капсули симбіотичних мікроорганізмів для азотфіксації. Найбільш перспективні такі напрямки вивчення сомаклональної мінливості: спрямована селекція сомаклонів, індукований мутагенез ін вітро, трансформація і перенос окремих генів.