Етапи мікроклонального розмноження рослин

Процес клонального мікророзмноження можна розділити на 4 етапи:

– вибір рослини-донора, ізолювання експлантів і одержання добре ростучої стерильної культури;

– власне мікророзмноження, коли досягається одержання максимальної кількості меристематичних клонів.

– укорінення розмножених пагонів з наступною адаптацією їх до грунтових умов, а при пониженій температурі (+2°С – +10°С).

– вирощування рослин в умовах парника і підготовка їх до реалізації чи посадки в полі.

Для культивування тканин на кожному з чотирьох етапів потрібне застосування певного складу поживного середовища.

На першому етапів необхідно домогтися одержання добре ростучої стерильної культури. В тих випадках, коли важко одержати вихідну стерильну культуру експланту, рекомендується вводити в склад поживного середовища антибіотики (тетрациклін, бензилпеніцилін та ін.) в концентрації 100 – 200 мг/л. це в першу чергу стосується деревних рослин, у яких спостерігається тенденція до накопичення внутрішньої інфекції.

На першому етапі, як правило, використовують середовище, яке містить мінеральні солі за рецептом Мурасига і Скуга, а також різні біологічно активні речовини і стимулятори росту (ауксини, цитокініни) в різних співвідношеннях в залежності від об’єкту. В тих випадках, коли спостерігається інгібування росту первинного експланту за рахунок виділення ним в поживне середовище токсичних речовин (фенолів, терпенів та інших вторинних сполук), зняти його можна, використовуючи антиоксиданти. Це можливо двома способами: або омивкою експланту слабким його розчином протягом 4 – 24 годин, або безпосереднім додаванням в поживне середовище. В якості антиоксидантів використовують: аскорбінову кислоту (1 мг/л), глютатіон (4 – 5 мг/л), дитіотриетол (1 – 3 мг/л), диетилдитіокарбомат (2 – 5 мг/л), полівінілпіролідон (5000 – 10000 мг/л). в деяких випадках доцільно додавати в поживне середовище адсорбент – деревне активоване вугілля в концентрації 0,5 – 1 %. Тривалість першого етапу може коливатися від 1 до 2 місяців, в результаті якого спостерігається ріст меристематичних тканин і формування первинних пагонів.

2 етап – власне мікророзмноження. На цьому етапі необхідно домогтися одержання максимальної кількості мері клонів, враховуючи при цьому, що зі збільшенням субкультивувань збільшується кількість рослин-регенерантів з ненормальною морфологією і можливо спостерігати утворення рослин-мутантів.

Як і на першому етапі, використовують поживне середовище за рецептом Мурасига і Скуга, яке містить різні біологічно активні речовини, а також регулятори росту. Основну роль при підборі оптимальних умов культивування експлантів відіграють співвідношення і концентрація внесених в поживне середовище цитокінів і ауксинів. Серед цитокінінів найчастіше найчастіше використовують БАП в концентраціях від 1 до 10 мг/л, а з ауксинів – ІОК і НОК в концентраціях до 0,5 мг/л.

При тривалому культивуванні рослинних тканин на поживних середовищах з підвищеним вмістом цитокінінів (5 – 10 мг/л) відбувається поступове накопичення їх в тканинах вище необхідного фізіологічного рівня, що призводе до появи токсичної дії і формуванню рослин зі зміненою морфологією. Разом з тим, можна спостерігати такі небажані для клонального мікророзмноження ефекти, як пригнічення проліферації пазушних меристем, утворення вітрифікованих (оводнених) пагонів і зменшення здатності рослини до укорінення. Негативну дію цитокінінів можна подолати, за даними Н.В. Катаєвої і Р.Г. Бутенко, шляхом використання поживних середовищ з мінімальною концентрацією цитокінінів, які забезпечують стабільний коефіцієнт мікророзмноження, або шляхом чергування циклів культивування на середовищах з низьким і високим рівнем фітогормонів.

3 і 4 етапи – вкорінення мікропагонів, їх наступна адаптація до грунтових умов і висадка в поле являються найбільш трудоємними етапами, від яких залежить успіх клонального мікророзмноження. На третьому етапі, як правило, змінюють основний склад середовища: зменшують в два, а іноді і в чотири рази концентрацію мінеральних солей за рецептом Мурасига і Скуга або замінюють його середовищем Уайта, зменшують кількість цукру до 0,5 – 1 % і повністю виключають цитокініни, залишаючи один лише ауксин. В якості стимулятору коренеутворення використовують β-індоліл-3-масляну кислоту (ІМК), ІОК або НОК.

Вкорінення мікропагонів проводять двома способами:

– витримування мікропагонів протягом кількох годин (2 – 24 год.) в стерильному концентрованому розчині ауксину (20 – 50 мг/л) і наступне їх культивування на агаризованому середовищі без гормонів або безпосередньо в підходящому грунтовому субстраті (імпульсна обробка);

– безпосереднє культивування мікропагонів протягом 3 – 4 тижнів на поживному середовищі, яке містить ауксин в невисоких концентраціях (1 – 5 мг/л в залежності від досліджуваного об’єкту). Останнім часом запропоновано метод укорінення пробірочних рослин в умовах гідропоніки. Цей метод дозволяє значно спростити етап укорінення і одночасно одержувати рослини, адаптовані до природних умов. Для картоплі можна використовувати безсубстратну гідропоніку для отримання міні бульб. Затінення нижньої частини культуральних ємностей цупкою чорною тканиною або додавання в поживне середовище активованого вугілля сприяє укорінення мікропагонів.

Пересадка рослин-регенерантів в субстрат являється відповідальним етапом, який завершує процес клонального мікророзмноження. Найбільш сприятливий час для пересадки пробірочних рослин – весна або початок літа.

Рослини з двома – трьома листками і добре розвиненою кореневою системою обережно виймають з колб або пробірок пінцетом з довгими краями або спеціальним гачком. Корені відмивають від залишків агару і висаджують в грунтовий субстрат, попередньо простерилізований при 85 – 90°С протягом 1 – 2 годин. Для більшості рослин в якості субстратів використовують торф,пісок (3:1); торф, дерновий грунт, перлит (1:1:1); торф, пісок, перлит (1:1:1). Виключення становить родина обхідних, для яких готують субстрат, що складається зі сфагнового моху, суміші торфу, листя бука або дуба, соснової кори (1:1:1).

Приготованим попередньо грунтовим субстратом заповнюють пікіровочні ящики або торф’яні горщечки, в яких вирощують рослини-регенеранти. Горщечки з рослинами поміщають в парники з регульованим температурним режимом (20 – 22°С), освітленістю не більше 5000 Лк і вологістю 65 – 90 %. Для кращого росту рослин створюють умови штучного туману. В тих випадках, немає можливості створити такі умови, горщечки з рослинами накривають скляними банками або поліетиленовими пакетами, які поступово відкривають до повної адаптації рослин.

Через 20 – 30 днів після посадки добре вкорінені рослини підгодовують розчинами мінеральних солей Кнудсона, Мурасіга і Скуга, Часникова, Кнопа (в залежності від виду рослин) або комплексним мінеральним добривом. По мірі росту рослин їх висаджують в більші ємності зі свіжим субстратом. Подальше вирощування акліматизованих рослин відповідає прийнятій агротехніки вирощування для кожного індивідуального виду рослин.

Процес адаптації пробірочних рослин до грунтових умов являється найбільш дорогою і трудоємною операціею. Нерідко після пересадки рослин в грунт спостерігається зупинка в рості, опадання листя і загибель рослин. Ці явища пов’язані, в першу чергу, з тим, що у пробірочних рослин порушена діяльність продихового апарату, внаслідок чого відбувається втрата великої кількості води. По-друге, у деяких рослин в умовах in vitro не відбувається утворення кореневих волосків, що призводить в свою чергу до порушення поглинання води і мінеральних солей з грунту. Тому доцільно на третьому чи четвертому етапах клонального мікророзмноження застосовують штучну мікоризацію рослин (для мікотрофних), враховуючи їх позитивну роль в постачанні рослин мінеральними та органічними поживними речовинами, водою, біологічно активними речовинами, а також в захисті рослин від патогенів.

Індійськими вченими запропоновано простий метод попередження швидкого зневоднення листя рослин, вирощених in vitro, під час їх пересадки в польові умови. Метод полягає в тому, що листя протягом усього акліматизаційного періоду слід оприскувати 50 %-ним водним розчином гліцерину або сумішшю парафіну, або жиру в діетиловому ефірі (1:1). Застосування цього методу допомагає уникнути довгих і ускладнених процесів загартування пробірочних рослин і забезпечує 100%-ве їх приживання.