Фактори, впливають на процес клонального мікророзмноження

На ефективність мікроклонального розмноження впливає маса факторів різної природи. Це фізіологічні особливості рослини, що вводиться в культуру, фізичні та хімічні умови культивування. Найбільш важливим моментом являється вибір материнської рослини і експланта.

При виборі материнської рослини необхідно враховувати її фізіологічні, сортові та видові особливості. Вихідні рослини повинні бути здоровими, не вражені грибними, бактеріальними і вірусними хворобами. Крім того, вони повинні знаходитися в стані інтенсивного росту (вихід з фази спокою і перехід до активного росту). Цибулини, кореневища і бульби в стані спокою непридатні, перед введенням в культуру їх попередньо обробляють високими або низькими температурами. Здатність до розмноження також детермінована генетично. Наприклад, суниця розмножується всіма способами, обліпиха – ні одним, хоча в природі черенкується. Дводольні володіють більшою регенераційною здатністю, ніж однодольні і деревні.

При виборі експланту необхідно враховувати його вік, будову і походження. Для забезпечення максимальної стабільності матеріалу, що клонується, для запобігання появи аномальних рослин в якості експланта бажано використовувати молоді, слабко диференційовані тканини. Крім того, експланти від ювенільних рослин краще укорінюються, ніж від дозрівши, особливо це стосується деревних порід. Краще за все використовувати кінчики стебел, пазушні бруньки, молоді листки, черенки, суцвіття, луску цибулин, тобто експланти, які містять меристеми. Досліди з ембріонами кукурудзи, проведені Гріном і Філіпсом у 1975 році, показали, що при вилученні ембріонів зі зрілих насінин вони утворюють каллус і корені. Якщо ж ізолювати їх через 2 – 3 тижні після запилення, то утворюється і каллус і рослини. Варто зазначити, що не завжди молоді тканини є вдалим об’єктом для розмноження. В ехеверії на експлантат з молодих листків виникають лише корені, зі старих – лише пагони, із середніх за віком – і пагони, і корені. Чим менше розмір експланту, тим менша його регенераційна здатність. З іншого боку, в крупному експланті збільшується можливість появи в його клітинах вірусів та інших патогенів, що перешкоджає оздоровленню тканин.

Тривалість культивування також впливає на ефективність мікророзмноження. Фізіологічний стан експланта змінюється протягом пасажів, при довготривалому культивування частота вкорінювання пагонів зростає. Можливо, що при цьому експлант набуває ознаки ювенільності, що призводить до підвищення його морфо генетичного потенціалу.

Успіх введення в культуру часто визначається ефективністю стерилізації. Вибір стерилізую чого агенту визначається особливостями експланту. Для ніжних тканин концентрація стерилізую чого агенту повинна бути знижена, щоб зберегти життєздатність експланту. Часто внутрішні зараження вихідних експлантів бувають трохи сильніші, ніж поверхневі, тому експланти попередньо обробляють фунгіцидами та антибіотиками проти грибної і бактеріальної інфекцій. Гарні результати дає обробка рослин бензоатом натрію.

У залежності від виду рослин необхідно випробовувати як тверді, так і рідкі поживні середовища. Іноді рідкі середовища мають переваги, так як забезпечують велику рухливість трофічних елементів. Наприклад, при розмноженні троянд більш успішним було культивування пагонів на двошаровому поживному середовищі: нижній шар – агаризований, верхній – рідкий. На ефективність розмноження можуть також впливати розташування експланту (горизонтальне чи вертикальне), тип пробок (ватні, пластмасові, скляні, металічні і т. д.), а також співвідношення об’єму експлантів і кількості поживного середовища для оптимального освітлення і газообміну експлантів.

Склад поживного середовища необхідно підбирати для кожного виду рослин. На клональне мікророзмноження впливають гормони, мінеральні солі, вітаміни і вуглеводи. При мікророзмноженні in vitro часто використовують середовища Мурасіге і Скуга, Лінсмейєра і Скуга, Шенка і Хільдебьрандта, Ніча, Гамборга, Хеллера та ін.. Зазвичай використовують середовище Мурасіге – Скуга, яка містить багато неорганічного азоту, що стимулює процеси органогенезу та соматичного ембріогенезу. В наших експериментах (Кузьміна Н.А., Внукова В.В.,1997) вихід морфогенних каллусів твердої пшениці був вищий на середовищі Мурасіге – Скуга в порівнянні з середовищем Гамборга, яка містила окислені форми азоту. Середовище Мурасіге – Скуга також сприяла стабілізації хромосомного набору клітин твердої пшениці при високому вмісті ауксину в середовищі. Взагалі питання оптимального співвідношення NH₄⁺:NO₃^- залишається відкритим, так як літературні дані досить протилежні і універсального рецепту для всіх видів рослин немає. В якості джерела вуглеводного живлення використовують різні вуглеводи типу сахарози, глюкози, фруктози, галактози. Різні культури потребують різної концентрації вуглеводів на різних етапах клонального мікророзмноження.

До фізичних факторів вирощування відносяться температура і умови освітлення. На перших двох етапах освітленість коливається від 1000 до 3000 Лк, фотоперіод14 – 16 годин, але ці параметри залежать від культури. Висока інтенсивність світла може викликати хлорози і затримувати розвиток, але при переносі в грунт ці рослини почувають себе краще і ростуть енергійніше. Спектральний склад також відіграє важливу роль. Деякі дослідники (Катаєва Н.В., Аветисов В.А., 1981) вказують на синє світло як основний компонент морфогенезу. Червоне світло стимулює утворення бруньок у тютюну, у салату – утворення пагонів, у берези – вкорінення. В роботах Т.Н. Константинової із співавторами (1987) показано, що синє світло посилює закладку вегетаційних бруньок у пагонів тютюну в умовах in vitro, а червоне стимулює розвиток квіткових бруньок. Однак при додаванні цитокінінів і ауксинів в різній концентрації співвідношення процесів диференціації квіткових і вегетативних бруньок змінюється, в деяких випадках спостерігається навіть протилежний ефект. В дослідженнях Р.А. Карначук і Є.С. Гвоздєвої (1998) найбільший вихід морфо генних каллусів пшениці, який формує рослини і пагони, відмічений на зеленому світлі. Важливе значення відіграє також поєднання спектрального складу світла і гормональних факторів середовища.

Температура культивування зазвичай варіює в інтервалі 22 – 26°С вдень і 18 – 22°С вночі. В деяких випадках пониження температури веде до підвищення ефективності розмноження. Для підвищення коефіцієнту розмноження необхідно кожному виду з урахуванням його природного ареалу зростання підбирати індивідуальні умови культивування. Відносна вологість повітря – 65 – 70 %.