Культури клітин вищих рослин. Історія методу

Найбільш ранні роботи по ізолюванню культур належать Блоцішевскому (1876), Брауну і Морісу (1892), Бонне, Саксу (1893). У цих дослідженнях зародки вичленяли з насіння і вирощували в штучних умовах. Першим дослідником, який зайнявся встановленням мінімального розміру експлантів, був Карл Рехінгер (1893). Він вирощував тонкі зрізи кореня буряків, кульбаби, сегменти стебла тополі на піску із застосуванням водопровідної води, без стерильних умов. Ці дослідження показали, що каллус утворюється при товщині зрізу не менше 1,5 мм. Ще в 19 столітті Х. Фехтінг провів ряд експериментів, які доводять тотипотентність клітини. При цьому в них переконливо виявлена полярність як органів, так і клітин.

Основи експериментальної ембріології рослин були закладені дослідженнями Моссарта (1902), який спостерігав набухання зав'язей деяких рослин після обробки їх спорами Licopodium, нежиттєздатними поллініями і водними екстрактами пилку. У зв'язку з цим було висловлено припущення, що пилкова трубка не тільки забезпечує пересування сперміїв до яйцеклітини, а й переносить в зав'язь ауксини, стимулюючі її ріст.

Г. Габерланд (1902) навчився культивувати окремі клітини протягом деякого часу. Але він вибрав для культивування зелені клітини, ізольовані з клітин палісадної паренхіми Lamium purpureum і волосків традесканції вірджинської і медунки м'якої, резонно розсудивши, що при цьому відпаде потреба в джерелах вуглеводів. Однак випустив з уваги те, що асиміляційні зелені клітини – зрілі та високодиференційовані, втратили здатність до меристематичної діяльності. Початкове припущення автора, що клітини, які містять хлорофіл повністю забезпечують себе поживними речовинами, необхідними для їх життєдіяльності і росту, не було підтверджено експериментально. Габерланд також висунув гіпотезу про тотипотентність будь живої клітини рослини, яка згодом була підтверджена експериментально. Ряд вчених, у тому числі і його учні, взяли з нього приклад і також отримали негативні результати. Деякі на підставі цього засумнівалися в гіпотезі тотипотентності рослинних клітин. Дослідження Габерландта з фотосинтезуючими клітинами були невдалі, що призвело до втрати інтересу до культивування тканин і клітин рослин. Проте вони все ж поклали початок пошуку адекватних поживних сумішей та умов, необхідних для підтримки росту органів, тканин і клітин рослин.

Поштовхом до відновлення робіт послужили дослідження Гаррісона, проведені в 1904 – 1907 рр.. Він виростив нейробласти жаби в лімфатичній рідині, довівши можливість вирощування in vitro ізольованих клітин. Великий вплив на напрям подальших робіт з рослинними клітинами надали роботи зоологів Карреля і Барроуза (1911) по культивуванні тканин і клітин ссавців на середовищі складного складу, що містить плазму крові та екстракти ембріональних тканин.

Французький вчений Мольяр вже в 1921 культивував сегменти кореня і гіпокотиля молодих пагонів редьки. Вони були здатні до росту в умовах культури, але при цьому не відбувалося формування нових тканин.

У 1922 р. один з учнів Рехінгера – Котте почав експерименти з позбавленими пігментів меристематичними тканинами – ізольованими кінчиками коренів, і добився успіху. Практично одночасно і незалежно від Котте Роббінс підібрав склад поживного середовища, що забезпечує в культурі росту апікальної меристеми кореня томатів і кукурудзи. Ці досліди поклали початок культивуванню ізольованих органів рослин на поживних середовищах. Не завжди ці дослідження були успішні. Під впливом робіт Карреля і Барроуза в 1927 році Прат почав культивувати клітини рослин на середовищах з добавками рослинних екстрактів. Результати його експериментів були негативні, тому що він обрав невдалі об'єкти для досліджень.

Початок тривалим і вдалим дослідженням з культивування клітин і тканин рослин поклали роботи американського дослідника Ф. Уайта і француза Р. Готра. Вони показали, що ізольовані органи і тканини можуть рости в культурі необмежено довгий час, якщо їх пересаджувати на свіже поживне середовище. Таку ж здатність спостерігав Ф. Уайт для клітин пухлинного походження. Результати чужих і власних експериментів Уайт узагальнив у монографії «Культура рослинних тканин», яка була перекладена на російську мову і видана в СРСР в 1949 році. У ній він виділяє кілька періодів в історії розвитку методу культури клітин, тканин і органів рослин:

1834 – 1900 рр. – Створення та розробка клітинної теорії.

1900 – 1922 рр. – Сформульована ідея культури тканин.

1922 – 1934 рр. – Безуспішні пошуки методів, що забезпечують тривале культивування тканин.

1934 – 1939 рр. – Детальна розробка техніки культури рослинних тканин.

Період 1940 – 1960 рр. значно розширив список видів, що вирощуються in vitro. У монографію Готра, що вийшла в 1959 р., включено вже 142 види. Був розроблений склад поживних середовищ, вивчено значення мікро- і макроелементів для підтримання нормальної ростової активності тканин, визначено вплив вітамінів і стимуляторів росту. Проводилися роботи з виявлення значення різних натуральних екстрактів (з ендосперму кокосового горіха, каштана, кукурудзи та інших рас тений) для підтримки неорганізованого клітинного росту, а також для стимуляції органогенезу. Показано значення кінетину для проліферації клітин in vitro та індукції стеблового морфогенезу. Вивченням цих питань займалися такі вчені, як Р. Хеллер, І. Ніч, Ф. Скуг, Ф. Стевард, Р.Г. Бутенко. В цей же час розроблені методи отримання і вирощування клітинних суспензій, а також культивування окремої клітини, ділення якої індукується за допомогою тканини-няньки.

У 1960 – 1975 рр. покладено початок методу одержання ізольованих протопластів з тканин кореня та плодів томатів шляхом обробки їх сумішшю пектолітичних і целлюлолітичних ферментів. Основоположник цього методу – Е. Коккінг. Були визначені умови культивування ізольованих протопластів, за яких вони утворюють клітинні стінки, діляться і дають початок клітинним лініям, здатним до морфогенезу. Були розроблені методи гібридизації соматичних клітин шляхом злиття протопластів та введення в них вірусних РНК, клітинних органел, бактерій. У лабораторіях Р.Г. Бутенко, Ю.Ю. Глеби проводилися дослідження поведінки ядерного та цитоплазматичного геномів партнерів в гібридних клітинних лініях і потомство соматичних гібридів рослин-регенерантів. У цей же період були розроблені методи отримання безвірусних рослин з меристематичних тканин. Почалися експерименти по створенню установок для глибинного культивування клітин.

Починаючи з 1976 р., розроблялися методи електрозлиття протопластів та селекції гібридних клітин, культивування гаплоїдних клітин і отримання нових форм і сортів сільськогосподарських рослин. Вдалося створити системи іммобілізованих клітин для отримання різних хімічних сполук і їх біотрансформації. Ведуться роботи по переносу генів у рослинні клітини та отримання трансгенних рослин.

Культивування соматичних клітин – характеристика, введена в культуру, пасивування.

В основі культивування рослинних клітин лежить властивість тотипотентності, завдяки якому соматичні клітини рослини здатні повністю реалізувати спадкову інформацію, тобто забезпечити розвиток всієї рослини. Слід зазначити, що на відміну від тваринної, рослинна клітина пред'являє менш жорсткі вимоги до умов культивування.

Змінюючи умови (додаючи до складу поживного середовища ті чи інші гормони), можна викликати диференціацію недетермінованих клітин. Культура рослинної тканини дозволяє отримати численні популяції в порівняно короткий час і в обмеженому просторі. Клітини в умовах in vitro позбавляються дуже багатьох важливих взаємодій, які визначають їх долю і диференціацію в цілому організмі. У певних межах диференціація культивованих клітин піддається контролю з боку експериментатора.

Основним типом культивованої рослинної клітини є каллус. Каллусна тканина – один з видів клітинного диференціювання, виникає шляхом неорганізованої проліферації дедиференційованих клітин органів рослини. У рослин в природі каллусна тканина виникає у виняткових обставинах (наприклад, при травмах) і функціонує нетривалий час. Ця тканина захищає місце поранення, може накопичувати поживні речовини для анатомічної регенерації або регенерації втраченого органу.

Утворення каллусу не завжди пов'язане з травматичним впливом. Каллус може виникнути і в результаті проліферації внутрішніх тканин експлантів без зв'язку з поверхнею зрізу через порушення гормонального балансу. Зростаючий каллус розриває шари тканини і розвивається на поверхні. Для отримання культивованих каллусних клітин фрагменти тканин різних органів вищих рослин – коренів, листя, стебел, пиляків, зародків (експланти) поміщають на штучне середовище, що містить ауксини, в пробірки, колби, чашки Петрі (in vitro).

В якості ауксинів використовують 2,4-дихлорфеноксіоцтову кислоту (2,4-Д), α-нафтилоцтову кислоту (НУК), індол-масляну кислоту (ІМК), індолілоцтову кислоту (ІОК) в концентрації 0,5 – 10 мг / л, в залежності від виду експлантів.

Процесу утворення каллусу передує дедиференціювання тканин експлантів. При дедиференціюванні тканини втрачають структуру, характерну для їх специфічних функцій у рослині, і повертаються до стану клітин, які діляться. Якщо експлант, що використовується для отримання каллусу, є фрагментом органу, то має у своєму складі епідермальні клітини, клітини камбію, судинної системи, серцевинною та первинної корової паренхіми. Переважно проліферують клітини камбію, кори, серцевинною паренхіми.

Різне тканинне походження каллусних клітин є однією з причин гетерогенності каллусних тканини, так як деякі функціональні особливості вихідних клітин передаються у ряді клітинних поколінь як стійкі модифікації. Як приклад можна привести процеси, що відбуваються при дедиференціюванні апікальної меристеми стебла. Після переміщення на поживне середовище меристеми стебла томатів відмічено припинення мітозу, клітини збільшуються в розмірах, втрачають характерну для меристематичноїї тканини форму, змінюється структура ядра і цитоплазми. У клітині, що готується до поділу підвищується синтез усіх форм РНК, зникають ткане специфічні білки-антигени і з'являються білки, специфічні як для клітин, які діляться, так і для каллусних тканини. Ці спостереження свідчать про зміни в активності генів і білкового апарату клітини при дедиференціюванні.

Активаторами матричної активності ДНК хроматину або активності РНК-полімерази є фітогормони. Рецепторні для фітогормонів білки, локалізовані в мембранах, мабуть, впливають у присутності фітогормонів на структуру і функцію мембран. Можливо, це обумовлює дію фітогормонів на генну активність.

Одним з найважливіших гормонів, що застосовуються при культивуванні in vitro є ауксин, який активує поділ та розтягнення клітин. Проникаючи в клітини, ІОК зв'язується зі специфічними рецепторами, впливаючи на функціональну активність мембран, полірибосом і роботу ядерного апарату. Встановлено, що в плазмалемі ауксин індукує роботу Н⁺-помпи, в результаті чого матрикс клітинних стінок розм'якшується, що є необхідною умовою для росту і розтягування клітин. Включена Н⁺-помпа посилює поглинальну активність тканин, збагачених ауксином. Передбачається, що надходження ауксину в клітину сприяє посиленню секреції кислих гідролаз і полісахаридів, необхідних для подальшого росту клітинних стінок. Під впливом ауксину зменшується тривалість різних періодів мітотичного циклу. Так, передбачається, що зменшується тривалість періоду подвоєння числа клітин, тривалість S – періоду, G1 – періоду. Все це призводить до значного прискорення темпів розмноження клітин.

Загальним моментом у дії ауксинів на ділення клітин є також попереднє посилення синтезу і накопичення РНК. Стимулююча дія ауксинів на синтез РНК може бути пов'язана з відновленням клітин після голодування перед їх входженням в мітотичний цикл, але може бути також приурочено до проходження клітинами етапів мітотичного циклу. Особливо виразно необхідність синтезу РНК проявляється при проходженні клітинами G1 – періоду. Під впливом ауксину посилюється синтез рРНК, але має місце і поява нових інформаційних РНК, причому на дуже ранніх етапах дії.

Здійснення клітинами підготовки до ділення на всіх етапах мітотичного циклу залежить від синтезу білків. Ауксин викликає як загальну стимуляцію їх синтезу, так і появу нових білків. Це дозволяє припустити існування в хроматині структурних генів, транскрипція яких специфічно індукується ауксином. Реалізація дії ауксину на хроматин і подальше ділення здійснюється внаслідок його проникнення в цитоплазму, утворення комплексу з цитоплазматичним ауксиновим рецептором і впливом цього комплексу на транскрипційну активність хроматину. Крім цього ауксин посилює окислювальну і фосфорилювальну активність мітохондрій, в результаті чого поліпшується енергетичне і субстратне забезпечення процесів синтезу РНК і білків, реплікація ДНК, а також здійснення самого мітозу. Цей ефект виявляється дуже рано і, як і синтез РНК, залежить від проникнення ауксину в клітину.

Для порушення процесів підготовки до поділу досить початкової короткочасної дії ауксину. Тому процеси, що відбуваються в клітинах під впливом ауксину, можна розділити на первинні, безпосередньо індуковані ауксином, і вторинні, що є наслідком первинної індукуючої дії. Виходячи з цього, можна припустити, що в мітотичному циклі рослинних клітин є короткочасні переходи, коли необхідна присутність ауксину в клітинах, і більш тривалі періоди, коли присутність ауксинів в клітині не є необхідною.