Морфофізіологічні характеристика каллусних тканин

Виділяють два типи культивованих рослинних клітин: нормальні і пухлинні.

Пухлинні клітини морфологічно мало відрізняються від каллусних. Фізіологічною відмінністю є гормононезалежність пухлинних клітин. Завдяки цій властивості пухлинні клітини діляться і ростуть на поживних середовищах без добавок фітогормонів. Ці клітини також позбавлені здатності дати початок нормально організованим структурам (корені, пагони) в процесі органогенезу. Іноді вони утворюють тератоми (потворні органоподібні структури), подальший розвиток яких неможливий.

Нормальні клітини в культурі можуть існувати у двох видах: у вигляді суспензії в рідкому поживному середовищі і на поверхні твердого поживного середовища у вигляді каллусу. Поверхневе культивування здійснюють на напіврідкому агаризованому середовищі, середовищі з додаванням інших гелеутворюючих полімерів, на дисках з поліуретану, на містках з фільтрувального паперу, напівзанурені в рідке поживне середовище. Можна також використовувати грудочки вати, просочені поживним середовищем, які зверху покриваються шматочком фільтрувального паперу.

Каллусна тканина, вирощена поверхневим способом, являє собою аморфну масу тонкостінних паренхімних клітин, що не має чітко визначеної анатомічної структури. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим, червоним. Залежно від походження та умов вирощування каллусних тканини бувають: - рихлі, сильно оводнені, легко розпадаються на окремі клітини; - середньої щільності, з добре вираженими меристематичними ділянками;- щільні, з зонами редукованого камбію і судин. Як правило, в тривалій культурі на середовищах, що містять ауксини, каллусні тканини втрачають пігментацію і стають пухкими.

У циклі вирощування каллусних тканини клітини після низки поділів приступають до росту шляхом розтягування, оскільки диференційована зріла каллусна тканина деградує. Для того, щоб не відбулося старіння, втрати здатності до поділу та подальшого росту, а також відмирання каллусних клітин, первинний каллус переносять на свіже поживне середовище через 28 – 30 днів, тобто проводять пасивування або субкультивування каллусної тканини.

Неорганізовано зростаюча каллусна тканина характеризується трьома типами клітин: дрібними, середніми і великими. При пасируванні тканини на середовище, що містить індуктори органогенезу, дрібні клітини починають ділення і формують меристематичні ділянки. Ділення клітин меристеми призводить або до формування бруньок та подальшого розвитку з них пагонів (геммогенез), або до ризогенезу.

Клітини меристеми з самих ранніх стадій розвитку відрізняються від каллусних високим вмістом РНК і білка. При утворенні соматичних ембріоїдів каллусна клітина середніх розмірів відокремлюється, обмежується щільною оболонкою, втрачає великі вакуолі. Вона містить велике структуроване ядро з ядерцем. Клітка ділиться мітотично, в результаті чого виникають 2 клітини проембрію. Наступні ділення клітин призводять до формування кулястого зародка, а також органу, аналогічного суспензорам в зародковому мішку сім’ядолі. Подальший розвиток соматичного ембріона через ряд стадій веде до регенерації цілої рослини з корінням і пагонами, так як в цьому випадку формується біполярна структура.

Каллуси з високими морфогенетичним потенціалом зазвичай матові, компактні, структуровані, мають зелені хлорофілвмісні ділянки, які представляють собою зони морфогенезу. Згодом там формуються пагони або рослини-регенеранти. У культурі також зустрічаються каллуси пухкі, що не мають глобулярного характеру. Такі каллуси або зовсім не здатні до органогенезу, або формують тільки коріння. Поява коренів свідчить про зрушення гормонального балансу в бік ауксинів, що перешкоджає утворенню пагонів. Ці каллуси можуть залишитися ризогенними, і регенерувати з них рослині не вдасться. Неморфогенні каллуси можуть бути переведені в суспензійну культуру для отримання вторинних метаболітів.

Перехід спеціалізованих неподільних клітин до проліферації пов'язаний з їх дедиференціюванням, іншими словами – втратою спеціалізації. В основі цього процесу, як і при диференціації клітин в інтактній рослині, лежить диференціальна активність генів. Структура та функції клітин визначаються активністю генів, і якщо клітини різняться за своєю структурою і функціями, то це обумовлено відмінностями в експресії їх генів, тобто спеціалізація забезпечується «включенням» різних генів в різних клітинах. Зазвичай активна невелика частина (5%) всього пулу генів, властивих даному виду. У цей склад активних генів входять, крім видоспецифічних і обов'язкових для підтримки клітинного метаболізму, гени, активні тільки в даному органі, тканини, клітині, а також гени, активні лише в певному віці або почали працювати лише під впливом змінених зовнішніх умов.

Виникнення фізіологічних і структурних відмінностей між клітинами і тканинами рослин, пов'язане з їх функціональною спеціалізацією, називають процесом диференціації. Поняття «диференціація» відображає перетворення ембріональної, меристематичної клітини у спеціалізовану. Меристематичні клітини, однотипні за структурою і функцями, починають розвиватися різними шляхами, створюючи тканини різних органів. Як це здійснюється – одине з найважчих питань клітинної біології. Між геномами в клітинах, які набувають різної форми і функції, мабуть, немає якісних відмінностей, і ці клітини починають відрізнятися тільки внаслідок різної експресії генів. Знову виникла клітина володіє широкими потенціями і може розвиватися будь-як з багатьох шляхів у морфологічному та фізіологічному сенсі.

Детермінація (визначення) шляхів розвитку кожної клітини є основою фізіології розвитку. Вступ на той чи інший шлях розвитку визначається особливим набором білків, тобто кожна спеціалізована клітина виробляє тільки їй властиві білки, що є наслідком диференціальної активності генів – експресії однієї групи генів при одночасній репресії інших. Здатність однієї зрілої соматичної клітини дати початок цілому організму (тотипотентність) показує, що в процесі нормальної клітинної диференціації у рослин не відбувається втрати або незворотної інактивації будь-яких генів.

У рослин майже всяка диференціація оборотна за умови, якщо диференційована клітина жива, в протопласті збереглося ядро і не утворилася вторинна оболонка. Навіть такі високоспеціалізовані клітини, як мікроспори, за допомогою ряду експериментальних процедур можна змусити до проліферації і дати початок цілій рослині. Отже, в певних умовах більшість із зрілих рослинних клітин зберігають здатність ділитися, а в деяких випадках навіть вступити на новий шлях розвитку. Однак питання про те, як це відбувається, які події на молекулярному рівні супроводжують цей процес, залишається відкритим.

Таким чином, після поділу перед кожною дочірньою клітиною відкривається одна з трьох можливостей. Клітина може залишатися ембріональною і знову вступити в клітинний цикл з подальшим мітозом або може виявитися як би «поза циклом» (Go), переставши ділитися, і нарешті, придбавши компетенцію, поступово детерміновануватися і вступити на шлях диференціювання (спеціалізації). Компетенція – здатність клітини сприймати індукуючий вплив і специфічно реагувати на нього зміною розвитку.