Культивування клітин. Історія методу

Визнання ідеї про те, що клітини тканин вищих тварин можна виділити з організму й потім створити умови для росту й відтворення їх in vitro, датується першим десятиліттям XX століття. Після того як стало відомо, що подібні процеси реальні, наступив другий етап робіт, початок якому поклала демонстрація можливості вирощування й репродукції в таких клітинах інфекційних агентів-вірусів. Третій етап історії починається із часу, коли була показана практична можливість одержання в клітинах тварин більших кількостей вірусного матеріалу для застосування у вакцинних препаратах, і триває до часу, коли: 1) стало можливим вставити в клітини специфічні екзогенно отримані гени й експресу вати їх; 2) підтверджена можливість вирощування в культурі з однієї клітини цілої популяції. Коли такі популяції одержували із клітини, що виділяла в навколишнє середовище антитіла, то всі молекули антитіл у надосадовій рідині були однаковими. Причини й наслідки цих двох феноменів у наш час інтенсивно досліджуються й вони знаменують собою початок четвертого етапу робіт у даній області.

Щоб показати здатність клітин тварин рости й ділитися в культурі, потрібно було опанувати ряд підходів і методик. Особливості їх наведені нижче.

1. Методики одержання клітин, вільних від екзогенних прокаріотів і грибів.

2. Методики розробки середовища, у якому ріст «вирізаних із тканини» або ізольованих клітин не придушується.

3. Методики спостереження за клітинами в динаміці їхнього розвитку.

4. Методики безперервного культивування культур клітин тварин in vitro і підтримка їх вільними від інших біологічних агентів.

Наукову основу для розробки цих методик складає уявлення про клітину як основний структурний елемент живих організмів тваринного й рослинного походження. Ідея про те, що клітини тканин тварин можна виділити з організму й потім створити умови для росту й відтворення їх in vitro виникла на базі концепції, що належить Клоду Бернару. Він припустив, що не тільки живі організми здатні зберігати сталість внутрішніх умов, не залежно від змін у навколишньому середовищі. Клітина поза організмом тварини теж буде прагнути підтримувати свої внутрішні умови. Якщо різниця між внутрішніми й зовнішніми умовами буде незначною, то висока ймовірність росту й розмноження клітини. Таке розуміння явища призводить до необхідності розробки середовищ, здатних підтримувати й стимулювати ріст клітин поза організмом.

Трохи пізніше, у 1885 році, У. Ру (W. Roux) показав можливість збереження поза організмом живих тканин на практиці. Він зберігав у життєздатному стані оболонку курячого ембріону в теплому фізіологічному розчині. Згодом він став автором, великої кількості робіт із проблем ембріології in vitro. Пізніше, в 1897 р., Льоб (Loeb) підтримував у життєздатному стані клітини крові й сполучної тканини в пробірках із сироваткою й плазмою крові. Льюнгрен (1898) показав можливість підтримки експлантатів шкіри людини в життєздатному стані в кислому середовищі зі збереженням здатності їх до реімплантації. Додаткові експерименти були проведені Джолі (1903), який спостерігав ділення клітини у висячій краплі, що містить лейкоцити саламандри, а Боб та Евінг (1906) підтвердили це при пересаджуванні лімфосаркомної тканини собаки.

Продовжуючи роботи Ру, Рос Харісон удосконалив методику «висячої краплі». Він використав невеликі шматочки тканини, відірвані від медулярної судини жаби і зануреного в її лімфатичний тромб, і витримував їх у вигляді краплі на нижній стороні покривного скла, розташованого поверх заглиблення в предметному склі. В 1907 р. йому вдалося спостерігати за допомогою такої «камери» ріст нервових клітин протягом декількох тижнів; він встановив, що швидкість росту цих клітин становить 20 мкм за 25 хв. У той час як експерименти Харісона були спрямовані на те, щоб одержати відповіді на питання, що відносяться до фізіології нервових клітин жаби, методика, якою він користувався, була застосована Барроузом для інших клітин тканин теплокровних тварин. Цей дослідник у 1910 р. замість лімфатичного тромбу використав тромб плазми курки.

У 1913 р. Алексіс Каррель застосував плазму крові, збагачену екстрактом ембріона. Додавання такого екстракту прискорювало ріст тканин. Застосована методика забезпечувала значно більшу ймовірність успіху, ніж та, яку використали Левіс (1911) і Рід (1908 р.). Рід готувала культури клітин з кісткового мозку морської свинки й намагалася вирощувати експлантати на середовищі певного хімічного складу. Робота Карреля привернула велику увагу, тому що вона була опублікована під інтригуючою назвою, – культивування «безсмертних» клітин. Інкубація клітин серця курячого ембріона була розпочата 17 січня 1912 р. Пересівання клітин продовжив Еблінг, як він сам заявляв, працюючи з ними 34 роки. Оскільки Каррель був хірургом і досить знаючим у питаннях асептики, він зміг внести істотний вклад у культивування клітин тварин in vitro. У той же час організація й технічні умови проведених експериментів були дуже громіздкими. Асистенти Карреля були одягнені в довгополі гумові халати темного кольору з капюшонами для повного прикриття голови. Процедури були тривалими й обтяжені багатьма деталями. У результаті тих вимог, які висувалися автором відносно складних мір обережності для запобігання контамінації, навколо даного предмета створилася атмосфера таємничості й винятковості, що скоріше гальмувало прогрес, ніж сприяло йому. Проте ним було досягнуто багато чого. Зокрема, навіть за відсутності антибіотиків він домігся успіху в пересадженні клітин, використовуючи хірургічну техніку для відторгнення окремих колоній і переносу їх у нові умови росту. Каррель також продемонстрував своїм колегам наукове значення тих спостережень, які можуть бути зроблені в процесі пересадження клітин.

У ході проведених робіт був внесений ряд виправлень у рецептуру середовища культивування. Зокрема, Тірод модифікував розчин Рінгера й на додаток до курячої сироватки й ембріонального екстракту почав використовувати коагулят фібрину. Для спостереження за діленням клітин тварин Канті в 1928 р. розробив метод кінофотомікрографії. У цей же період був розроблений додатковий і дуже істотний підхід у техніці роботи із клітинами. Мається на увазі застосування трипсину для вивільнення клітин з тканинної матриці, у якій вони перебувають. Однак ця методика не знаходила визнання доти, поки в 1937 р. Сіммс і Стідлман використали її для пассирування клітин між культурами плазми. Ця методика дає можливість успішно застосовувати в культурах індивідуальні клітини, а не тканини.

Уперше клони клітин у культурі з одиночної клітини були отримані Ерлом зі співробітниками в 1948 році. Ігл (1955) систематично досліджував харчові потреби клітин в умовах. Доти поки в 1961 р. Хейфлік і Мурхед не виділили лінію диплоїдних клітин людини (ДКЛ) WI-38, вважалося, що один раз встановлена клітинна лінія має необмежений час життя. Щодо лінії WI-38 було показано, що період її існування в культурі обмежується приблизно 50 подвоєннями популяції. Перед відмиранням популяції для клітин цієї лінії характерний феномен старіння. Однак при відмиранні ці клітини залишалися диплоїдними й не мали ознак злоякісних змін. Клітини, виділені з ракових пухлин або трансформовані в ході культивування, характеризуються «безсмертністю» і корелюють із гетероплоїдністю. Перші суспензійні культури клітин тварин, як правило, ґрунтувалися на клітинах злоякісних тканин. Це – клітини HeLa, виділені з ракової пухлини шийки матки людини. Перевиваюча лінія карциноми шийки матки була виділена ще в 1952 році Джеєм зі співробітниками, вона використовується й у наш час у багатьох лабораторіях світу.

Наступний етап в історії культивування диплоїдних клітин людини пов'язаний із установленням факту, що вони є генетично стабільними й вільними від всіх відомих латентних й онкогенних вірусів. Тому лінії диплоїдних клітин людини дозволено застосовувати для одержання продуктів, що призначені для людей. Ця догма залишається діючою й у наш час, хоча новітні відкриття чітко показали наявність у клітинах, виділених з нормальних тканин, потенційних онкогенів, ідентичних тим, які знайдені в таких відомих онкогенних вірусах, як вірус саркоми Рауса й вірус саркоми Молони. Раус ще в 1910 році індукував пухлину, використавши профільтрований екстракт курячої пухлини. Ця пухлина була індукована РНК-вірусом (вірус саркоми Рауса). Пізніше було встановлено, що ряд вірусів здатні індукувати виникнення пухлин, такі віруси отримали назву онкогенних.