Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту

При одержанні клітинних ліній з корисними ознаками постає проблема збереження цих ознак. Рослини можуть зберігати генетичну інформацію в насінні, однак це джерело не зовсім надійне, так як з часом із-за мутацій схожість насіння падає. Крім того, деякі рослини розмножуються лише вегетативно. Цим обумовлена необхідність збереження частини матеріалу in vitro. З іншого боку, в деяких випадках вдається отримати нові клітинні лінії, які синтезують більшу кількість вторинних метаболітів, тобто більш продуктивні, які також потребують збереження.

Для дослідження фізіологічних і біохімічних процесів, які протікають в тканинах, також потрібні стандартні вихідні культури, чим викликана необхідність зберігати матеріал протягом певного проміжку часу, коли відбуваються серійні експерименти. Все це робить проблему збереження генофонду досить актуальною.

Можна, звичайно, пасирувати і переприщепати клітинні культури. Однак при цьому виникає небезпека сомаклональної мінливості, накопичення мутацій, контамінацій (зараження чужорідним генетичним матеріалом). Це також потребує певних фінансових і трудових затрат (необхідність частих пересадок, витрати, пов’язані з середовищем і т.д.). Мета дослідників полягає у збільшенні інтервалу між пересадками.

Існують різні підходи до збереження культур:

– кріозбереження;

– уповільнення росту;

– сушка (розпилююча і ліофільна) – для клітин мікроорганізмів.

Кріозбереження – заморожування при зверх низьких температурах. Звичайно його проводять в рідкому азоті, при температурі – 196°С.

Успіх низькотемпературної консервації залежить від ряду факторів: вид і тип клітин; їх концентрація в суспензії; склад середовища для консервування; вид і концентрація кріопротектора; режим охолодження і відігріву; спосіб реабілітації клітин після відігріву.

Істотну роль в успішному заморожуванні клітин відіграє їх морфо фізіологічний стан: клітини, що знаходяться в стаціонарній фазі росту, менш стійкі до шкідливої дії низькотемпературної консервації, ніж клітини, які знаходяться в експоненціальній фазі росту. Клітини для заморожування відбирають в середині експоненціальної фази ростової кривої.

Немаловажне значення має і густина заморожуваної суспензії. Оптимальні результати по відновленню клітин були одержані при заморожування клітинної суспензії густиною 1×10⁵ – 5×10⁶ клітин в 1 мл.

Для рослинних клітин часто потрібне попереднє культивування в особливих умовах. В середовище додають різні речовини, наприклад:

– 2 – 6 % маніт або сорбіт для зменшення розміру вакуолей;

– амінокислоти, в першу чергу пролін, який служить для зв’язування води в клітині (концентрація до 1 моля або 11,5 %), аспарагін, γ-аміномасляну кислоту;

– диметилсульфоксид (ДМСО), який додають до середовища для перед культивування в концентрації від 2,5 до 10 % на 48 годин для збільшення проникності цитоплазматичної мембрани;

– крім того, застосовують штучне загартування до холоду, коли понижують температуру культивування, імітуючи природний осінній процес підготовки до періоду зимового спокою (застосовують лише для рослин помірного клімату). Клітинні культури витримують кілька діб при температурі +8 – +10°С протягом 1 – 6 тижнів.

Процес заморожування рослинних клітин від тваринних відрізняє, в основному, наявність етапу попереднього культивування.

Кріопротектори – речовини, які дозволяють знизити шкідливий вплив фізико-хімічних факторів при кріоконсервуванні. До них відносяться сахароза, декстран, етиленгліколь, полівінілпіролідон, диметилсульфоксид (ДМСО), гліцерин. Для визначення токсичності кріопротектору клітини витримують при кімнатній температурі в різних його концентраціях протягом 30 – 50 хвилин, після чого визначають їх життєздатність. Додатково оцінюють його проективні властивості шляхом пробного заморожування і відтавання культур. Найчастіше в якості кріопротекторів використовують гліцерин і ДМСО. Перед додаванням кріопротектору суспензію клітин концентрують шляхом центрифугування, над осадову рідину зливають. Кріопротектори вносять в культуру за годину до заморожування, що призводить до зміни проникності мембрани, зміни точки замерзання і відтавання.

Програми охолодження можуть бути різними, але для всіх них характерна повільна швидкість охолодження. При заморожування відбувається утворення льоду всередині і зовні клітин. Характер цих змін залежить від зразка, що вивчається, і обробки кріопротекторами, але головним чином, від швидкості охолодження. При повільному охолодженні відбувається утворення позаклітинного льоду, який призводить до зневоднення клітини до того, як буде досягнуто точки замерзання цитоплазми. При швидкому охолодженні клітини швидше заморожуються зсередини, повільніше зневоднюються, що призводить до утворення кристалів льоду всередині клітини. В цьому випадку клітини пошкоджуються. Зазвичай охолодження проводять в два етапи: 1-й етап: від 20 до -28°С зі швидкістю 1 градус за хвилину (для рослинних клітин швидкість заморожування 0,5 градуса за хвилину до -35°С), витримують при цій температурі 15 хвилин. 2-ий етап: занурення в рідкий азот (миттєве охолодження до -196°С).

Заморожування здійснюють в спеціальних апаратах. За їх відсутності – на спиртовій бані (0,5 – 1 літр спирту наливають в термос з металічною колбою, занурюють в нього ампули на 15 хвилин і додають при помішуванні рідкий азот або сухий льод; доводять температуру до -32°С (температура повинна бути не вище -28 і не нижча -32°С). Далі переносять ампули в рідкий азот.

При розморожуванні ампули пінцетом переносять у водяну баню з температурою +37 – +40°С, ампула, об’ємом в 1мл розморожується протягом 0,5 – 1 хвилини.

Після розморожування клітини відмивають або в ростовому середовищі (тваринні), або в підтримуючому середовищі. Рослинні клітини також можна відмивати 3 – 10 % розчином сахарози.

Потім клітини перевіряють на життєздатність за допомогою вітальних фарбників, які зафарбовують мертві клітини. Кінцевим критерієм служить чітке відновлення росту на стандартних поживних середовищах, яке використовується для даної культури.

Перещеплювані культури тваринних клітин після розморожування мають підвищену чутливість до вірусів, яка проявляється протягом перших двох пасажів. Потім чутливість повертається до вихідної.

Уповільнення росту можна домогтися наступними методами:

– зберігання під шаром мінерального масла (для бактеріальних культур);

– зміна газового складу і атмосферного тиску всередині культуральної посудини;

– зміна світлового режиму;

– охолодження до температури припинення активного росту;

– застосування гормональних і осмотичних інгібіторів. З гормональних інгібіторів найчастіше використовують хлорхолінхлорид (для рослинних клітин), з осмотичних – маніт в концентрації 3 – 6 %.

– заміна СaCl₂ на Ca(NO₃)₂ в поживних середовищах.

Для картоплі в якості способу, який дозволяє зберегти генофонд, рекомендується бульбоутворення в пробірках.