Поживні середовища й умови культивування

Після виділення клітин із тканини або організму й поміщення їх у культуру культуральне середовище повинно забезпечувати всі зовнішні умови, які клітини мали in vivo. Це забезпечує виживання клітин, їхню проліферацію й диференціацію. Позаклітинне середовище повинно забезпечувати клітини поживними й гормональними факторами, тобто мати все необхідне для росту й виживання клітин.

Культури клітин тварин і людини висувають певні вимоги до рідкої (поживне середовище), газоподібної (концентрація газів) і твердої (поверхня субстрату) фази. Поживне середовище представляє собою розчин певного складу, до якого додаються компоненти нез’ясованого біологічного походження (добавки плазми, сироватки крові, тканинні екстракти й т.д.). Основу поживних середовищ складають сольові розчини. Мінеральні компоненти в цих розчинах підібрані так, що розчин виконує буферні функції, підтримуючи постійний кислотно-лужний баланс середовища в процесі культивування. Сталість рН середовища є однією з головних вимог щодо умов культивування.

Для приготування поживних середовищ зазвичай використовуються сольові розчини Ерла й Хенкса. Ці розчини, як і фосфатносольовий буфер Дульбеко й Фогта використовуються також для зрошення й промивання клітин при пасирувані культур, виділенні клітинних ліній й інших маніпуляцій з культурами клітин. Іншою важливою умовою культивування є осмотичний тиск. Він визначається числом молів осмотично активних часток (іонів і неіонізованих молекул) розчинених речовин на 1 кг розчинника (осмоляльність) або на 1 літр розчину (осмолярність). У розведених водних розчинах ці величини близькі. Осмоляльність розчину (осмоль/кг) = S•m_i•x_i, де m_i – концентрація 1-ї розчиненої речовини (моль/кг), x_i – кількість часток, на які дисоціювала його молекула. Наприклад, для розчину Ерла розрахункова величина осмоляльності дорівнює 310,6 мосмоль/кг, реальна 283. Діапазони рН й осмоляльності, при яких відбувається розмноження клітин, вузькі й варіюють залежно від типу клітин. Наприклад, для клонального росту диплоїдних фібробластів людини WI38 оптимальні рН=7,30 + 0,15 й осмоляльність 285 + 40 мосмоль/кг, а для фібробластів з ембріона курчати 7,12 + 0,18 й 300 + 20 відповідно. Для підтримки рН у більшості середовищ використовується бікарбонатний буфер: HCO₃ = CO₂ + OH^–, якщо виділяється вуглекислий газ, збільшується концентрація ОН. Розчини можуть містити малу кількість бікарбонатного буфера (розчин Хенкса), вони призначені для підтримки рН у щільно закритих судинах. В інших (розчині Ерла) бікарбонату більше, вони використовуються в системах з підвищеним парціальним тиском СО₂. Якщо культивування ведеться поза СО₂ інкубатором, де рН підтримувати важче, необхідні альтернативні буферні системи. Гарним буфером є HEPES 4-(2-оксиетил)-1-піперазинетансульфонова кислота. HEPES легко розчинний у воді, не зв’язує двовалентні катіони, не цитотоксичний до концентрації 0,05 Моль. Застосовується в концентраціях 0,01 – 0,03 М.

Стандартні середовища для ведення культивування тваринних клітин. Середовища Ігла MEM (minimal essential medium) і BME (basal medium, Eagle). Частіше використовується МЕМ. Воно містить мінеральні речовини, амінокислоти (13 незамінних), 6 водорозчинних вітамінів, холін й інозит, що виконують роль вуглеводного субстрату. МЕМ використовується тільки із сироваткою, тому що в ньому відсутні біотин, вітамін В₁₂, іони заліза й мікроелементи. Основа розчин Ерла.

Середовище Дульбекко DME або DMEM (подвійна модифікація середовища Ігла). Використовується при культивуванні клітин різних типів, у тому числі нетрансформованих клітин і гібридів. Є основою для безсироваткових середовищ. Містить подвійну концентрацію амінокислот, гліцин, серин, піруват, залізо. При використанні цього середовища необхідний інкубатор з 10% концентрацією СО₂.

Середовище Іскова IMDM – модифікація середовища Дульбекко. Додано незамінні амінокислоти, біотин, вітамін В₁₂, селеніт натрію. У середовище введений HEPES і зменшені концентрації NaCl й NaHCO₃. Середовище безсироваткове, звичайно використається для культивування лімфоцитів і кровотворних клітин.

Середовище Маккоя 5А та серія середовищ RPMI. Середовище Маккоя 5А розроблене в 1958 році для підтримки клонального росту клітин карциносаркоми Уолкера 256 у присутності сироватки, а потім уже інших первинних культур і різних клітинних ліній. Зазвичай виробляється в модифікації Івката й Грейса (RPMI) і призначена для культивування лейкоцитів у присутності сироватки, часто застосовується й для культивування гібридів. Концентрація СО₂ в атмосфері при культивуванні 5%.

Середовище 199 розроблене в 1950 році для культивування фрагментів серця з ембріона курчати. Для середовища характерний широкий спектр поживних речовин і невисока їхня концентрація. Використовується без добавок, як підтримуюче для первинних клітин, а із сироваткою як ростове середовище для клітин, що швидко розмножуються. Для оптимального росту клітин зазвичай додають 5 – 20% фетальної (ембріональної) сироватки.

Сироватка представляє собою надзвичайно складну суміш малих і великих молекул, здатних як викликати, так і гальмувати ріст клітин. До головних функцій сироватки відносяться: забезпечення гормональними факторами, що стимулюють ріст клітин і їх функції; забезпечення факторами прикріплення й розшарування клітин; забезпечення транспортними білками, що переносять гормони, мінеральні речовини, ліпіди й т.д. Білки сироватки, які прямо й специфічно беруть участь у стимуляції клітинного ділення, називаються факторами росту.

Більшість ростових факторів присутні в сироватці в концентрації декількох нанограмів на мілілітр і нижче. Деякі із цих факторів специфічні для клітин на певній стадії диференціації, дія інших не обмежена яким-небудь одним типом клітин. Той самий тип клітин може бути стимульований різними ростовими факторами. Наприклад, фібробласти розмножуються у відповідь на фактор росту фібробластів, фактор росту епідермісу, фактор росту, синтезований тромбоцитами й соматомедінами. Всі ці речовини є мітогенами (стимулюють мітоз). Іншим важливим фактором росту практично для всіх типів клітин є гормон інсулін. З інших гормонів найчастіше застосовуються глюкокортикоїди (гідрокортизон, дексаметазон), стероїди (естрадіол, тестостерон, прогестерон) і гормони щитовидної залози (трийодтиронін). Гормони стимулюють або пригнічують ріст залежно від типу клітин й їхньої густини. Глюкокортикоїди, наприклад, впливають на проліферацію клітин, змінюючи їхню чутливість до факторів росту.

Для переносу низькомолекулярних факторів (вітамінів, амінокислот, ліпідів й інших) необхідні транспортні білки. У цій ролі виступає альбумін. Транспорт заліза забезпечує трансферин, а поверхня більшості культивованих клітин містить рецептори для цього білка. До факторів прикріплення й розшарування клітин відносяться колаген і фібронектин, більш спеціалізовані хондронектин (адгезія хондроцитів) і ламінін (адгезія епітеліальних клітин).

В останні роки розроблені безсироваткові середовища для розмноження клітин. Найчастіше ці середовища вузько спеціалізовані, тобто призначені для певного типу клітин. До базового середовища додається інсулін, трансферин, гідрокортизон або його аналог дексаметазон і т.д. Безсироваткові середовища мають певні переваги: поліпшення відтворюваності результатів досліду внаслідок більшої стабільності складу середовища; зниження ризику зараження культури вірусами, грибами, мікоплазмою; полегшення очищення продуктів клітинного метаболізму; зниження впливу додаткових білків на результати біологічних досліджень; відсутність цитотоксичності сироватки. Культивування клітин у присутності сироватки має й ряд недоліків: для більшості тканин сироватка не є фізіологічною рідиною, з якою вони контактували у вихідній тканині, тому, наприклад, сироватка викликає ріст фібробластів, але гальмує ріст епідермальних кератиноцитів; сироватка може бути цитотоксичною, тому що містить поліаміноксидазу, яка діє на поліаміни (спермін, спермідин), що є продуктами секреції швидко проліферуючих клітин (ембріональна сироватка містить відносно багато такого ферменту); значна варіабельність складу сироваток різних партій; сироватки можуть містити недостатню кількість специфічних ростових факторів, що викликає необхідність додавання їх до культур клітин.

Багато клітин ссавців, перш ніж розпочати проліферацію й утворити клітинний моношар, повинні прикріпитися до субстрату й розшаруватися на ньому. У зв’язку із цим постає питання про відповідний матеріал. Як субстрат у наш час використовують кілька матеріалів. Скло пірекс (алюмоборосилікатне скло) найкраще, тому що натрійсилікатне скло може підлужувати середовище і його необхідно кип’ятити в слабкій кислоті перед уживанням. З кожним використанням придатність такого скла падає. Пластик – найчастіше використовують полістирол, полікарбонат, полівінілхлорид, тефлон й ін. Метали – підходить як нержавіюча сталь, так і титан, тому що ці речовини хімічно інертні й мають високий негативний поверхневий заряд. Клітини прикріплюються за рахунок електростатичних взаємодій, тому поверхня культуральних судин повинна бути змочена й негативно заряджена. Цього можна досягти хімічною обробкою окислюючими агентами, або фізичними впливами (високовольтним розрядом, ультрафіолетовим світлом, бомбардуванням високоенергетичними електронами). Фірми, що виробляють пластиковий посуд, використовують ці методи. Деякі дослідники, незважаючи на цей, навіть новий посуд перед посадкою клітин обробляють сумішшю концентрованої сірчаної кислоти й біхромату калію (хромова суміш), після чого ретельно промивають. Іноді поверхню судини покривають речовиною, що полегшує прикріплення клітин. Найчастіше для цього використовують колаген і поліамінокислоти.