А. КУЛЬТУРИ КЛІТИН

Введення вірусів грипу А або В в (Культуру клітин викликає один з трьох ефектів: 1) вірус розмножується з різною ефективністю , утворюючи інфекційне потомство (продуктивна інфекція); 2) вірус проходить неповний цикл репродукції з утворенням неповного (вірусу на поверхні клітин або неінфекційних вірусних частинок в середовищі (абортивна інфекція); 3) вірусу не вдається інфікувати Кленк. Деякі експериментальні дані (дозволяють вважати, що. Можна встановити стан хронічної інфекції, при (якому невеликі кількості інфекційного вірусу виділяються в середовище протягом тривалого часу (іереістентная інфекція).

1. Продуктивна інфекція

реплікативного цикл вірусів грипу детально описаний

в гол. 8. За введенням вірусу <в 'культуру чутливих кле

ток слід період «затемнення» ^ тривалістю прибли

зительно 2 год, протягом якого не виявляється яких-

або 'біологічних чи серологічних проявів синтезу

вірусних білків . Протягом цього періоду йде синтез вірус-

специфічних яоліпептідов,: у тому числі вірусслеціфіче-

окіх 'компонентів, що не инкорпорируются в вирион.

Приблизно через 2 год після зараження в клітинах можна

виявити антиген нуклешротеіда (NP). Кількість цього

компонента досягає максимуму до 5-6-му годині після зара

жения. Присутність гемаглютиніну або поверхневих ан

антигеном в екстрактах клітин виявляється через 3 год після

зараження. нирку вірус може бути виявлений на

оболонках клітин через приблизно 5 '/ г год після зара

жения. Незабаром після цього, приблизно через 6 год після зара

жения, починається вихід вірусу в середу, і інфекційний

вірус 'досягає максимальної. концентрації в середовищі через

7-8 год після зараження

При зараженні (вірусом грипу людини різних первинних (культур клітин, отриманих з тканин птахів або ссавців, в них (відбувається продуктивний цикл. Перелік, цих культур можна знайти у Hoyle (1968). Для того щоб не повторювати цей перелік, ми постараємося підсумувати, найбільш суттєві ^ досягнення, отримані рядом дослідників «а протягом більше 20 років експериментальної; роботи.

Епітеліоподібні клітини є найбільш чутливою, системою для культивування in vitro обширного ряду штамів вірусу грипу А і В. Частіше за інших використовують для цих, цілей нирки плоду людини (Mogabgab et al., 1954), макак резусів або зелених мавп (Mogabgab et al., 1961), нирки телят (Haas, Wulff, 1957; Lehmann-Grube, 1965 ), свиней. (Lehmann-Grube, 1964), а також хом'яків (Heath, Tyrrell,. 1959) '. З них частіше використовують первинні клітини нирок, мавп, людини і телят. Зазвичай воліють нирки мавп, що обумовлено швидкістю «х зростання і зручністю в. зверненні.

Не всі культури елітеліоідних клітин пермісивними для вірусу (гріппа. Первинні диплоїдні і гетероплоідние клітини людського амниона, так само як і інші (гетероплоідние епітеліальні клітини, зазвичай нечутливі до нього. До гетероплоідним клітинам відносяться такі лінії, ясак HeLa, KB, клітини кон'юнктиви (Green et al., 1957), а також MAF і клітини серця і кишечника людини (Wong, Kilbour-ne, 1961).

Культури епітеліощдних клітин, отримані з органів,, володіють більш однорідною чутливістю до вірусів грипу, ніж культури, отримані з органів ембріона. За нашими даними, культури клітин, приготовані з нирок, мертвонароджених (Немовлят, настільки ж чутливі до вірусів грипу, як культура клітин нирок мавп, а культури клітин ембріональних нирок людини менш чутливі. Істотною проблемою при використанні ембріональних нирок людини є різниця в чутливості між різними партіями клітин. Нирки зазвичай отримують від ембріонів різного віку, умови їх отримання теж варіюють, в результаті чого сильно (коливається відсоток життєздатних клітин. Ці фактори призводять до великої різноманітності в співвідношенні між епітеліоїдними і фиб - робластоіодобнимі клітинами в культурах нирки ембріона, людини. Це в свою чергу може призвести до значних варіацій в чутливості до вірусів. Епітеліоподібні клітини на відміну від фібробластоідних підтримують реплікацію вірусу. Аналогічні дані відлучені щодо клітин нирок свиней. Культури, отримані з нирок дорослих свиней, складаються в основному з епітеліоїдних «вічко, які підтримують реплікацію вірусу грипу. Культури, отримані з ембріональних нирок, майже повністю представлені фіброблаетамі і практично нечутливі до вірусу (Lehmann-Grube , 1964). Ця закономірність має місце у багатьох видів.

Чутливість епітеліоїдних клітин до грипозної інфекції знижується при субкультівірованія. У деяких випадках, наприклад при використанні «льоток нирки ембріона людини, субпаосаж сприяє проліферації фібро-бластів , нечутливих до вірусу. В інших випадках, наприклад при використанні нирок мавп (Dowdle, неопубліковані дані) і теляти (Lehmann-Grube, 1964), культури клітин зберігають свої епітеліоїдні властивості при численних пасажах, але спектр їх чутливості до вірусів змінюється вже при першому субкультівірованія. Ді-плоїдність епітеліоїдних (клітин сама по собі ще не визначає чутливість до вірусів.

Деякі віруси можуть розмножуватися або купувати здатність до розмноження після адаптації в фіброблаетах або в гетероплоідних лініях клітин, але таких штамів мало . Штам NWS вірусу грипу A (iHONl) унікальний за широтою клітинного спектра; він може розмножуватися в гетероплоідних епітеліальних клітинах (Wong, Kilbourne, 1961), в фібробластах (Kilbourne et al., 1964) і IB MDBK, гетеро-плоідной лінії клітин бичачої нирки (Choppin, 1969). Вірус грипу В теж здатний розмножуватися в гетероплоідной лінії, отриманої з нирок собак (Green, 1962).

Специфічність відносно клітини-господаря не завжди вдається передбачити. Віруси грипу свиней не розмножуються в культурі клітин нирки людини (Hinz, Syverton, 1959), але віруси грипу людини добре розмножуються в клітинах нирок свиней (Lehmann-Grube, 1964). Культура клітин нирок мавп нечутлива до вірусів грипу коней (Heq2Neq2) при зараженні безпосередньо клінічним матеріалом , але ті ж віруси розмножуються в клітинах нирки мавп після одного пасажу на курячих ембріонах (Dowdle et al., 1963).

Недостатньо повне усунення сироваткових компонентів перед інокуляцією вірусу є однією з головних лрічін виділення вірусу в малому відсотку випадків та отримання низьких інфекційних титрів в чутливих культурах клітин. Компоненти сироватки, що представляють собою необхідну складову частину середовища для росту клітин, можуть неспецифически нейтралізувати вірус. Це найбільшою

мірою стосується вірусів, виділених після 1957 м. Інгібіт-ючий дію сироватки може бути усунуто за допомогою дворазової або багаторазової відмивання клітин середовищем,. що не містить сироватки.

2. Абортивна інфекція

Henle і співавт. ( 1955) першими показали, що клітини HeLa (з карциноми шийки матки людини), заражені при великій множинності розмноженим на курячих ембріонах вірусом, продукують неінфекційні гемагглю-тінірующіе частинки. Абортивна інфекція спостерігається і в клітинах L, заражених FPV (Franklin, Breitenfeld, 1959) , а також у різних лініях клітин, заражених вірусом грипу свиней (Wong, Kilbourne, 1961), виданню клітинах аецітной пухлини Krebs-2 (Low et al:, 1962), в клітинах ВНК-21 (Fra-ser, 1967) і в клітинах BSC-1 (Nikitin et al., 1972). Абортивна інфекція спостерігається не тільки в гетероплоідних клітинах, але також і в диплоїдних фібробластах людини (Kilbourne et al., 1964).

Механізм абортивної інфекції не цілком ясний; ймовірно, блокується якась стадія циклу репродукції вірусу. У дослідах з вивчення неповних циклів репродукції вірусу грипу в клітинах HeLa (Henle et al., 1955) або в клітинах L (Franklin, Breitenfeld, 1959) було відмічено утворення значного кількості як NP-антигену, так і гемагглюті-нірующіх частинок. Loffer і співавт. (1962) показали, що при абортивної інфекції в клітинах HeLa NP накопичується в ядрі, а звільняються вірусні частки не містять повної послідовності нуклеотидів вірусної РНК. Choppin і Pons ( 1970) виявили, що в цих гемагглюті-нірующіх неінфекційних частинках відсутня найбільший з 'фрагментів вірусної РНК, але мається підвищена кількість малих фрагментів РНК-Ці автори також знайшли, що клітини HeLa можуть продукувати інфекційний вірус, якщо в інокуляти відсутня неповний вірус. В цьому відношенні абортивна інфекція в клітинах HeLa схожа з класичним феноменам фон-Mairayea, тобто з продукцією неповного вірусу в курячих ембріонах.

3. персистентно інфекція

Ряд експериментальних даних дозволяє припускати можливість хронічної інфекція, супроводжуваної низьким виходом вірусу, спричиненої вірусами грипу в культурах тканин. Tyrrell (1959) описав хронічну інфекцію культури клітин нирки телят вірусом WS. Гаврилов і співавт. (1972) виявили, що три пасирування жлеток нирок сві-

ній, заражених вірусом WSN, вірус міг бути виявлений протягом 105 днів. Willinson і Barland (1972) показали персистенцию вірусу P.JR8 протягом 50 днів після зараження їм культури «льоток легкого людини. В культурі не розвивався цітоіатіческій ефект, а в культуральній рідині виявлялися невеликі кількості інфекційного вірусу. Такі повідомлення показують, що принаймні деякі штами вірусу грипу можуть викликати розвиток короткочасної хронічної інфекції, але «справжня» персистентная інфекція з вірусом грипу ще не продемонструвала.

4. Параметри інфекції

а) вірусспеціфіческой компоненти в клітці. Метод, флуоресцентних антитіл (ФА), 'запропонований Weller і Coons (1954), широко використовували як імунологічного тесту для 'ідентифікації та локалізації вірусспеці-фических антигенів у заражених' клітинах. Прямі та непрямі методи імунофлюоресценції в застосуванні до вірусів були детально описані в огляді Liu (1969). Раніше інших цей метод застосували до вірусу грипу Watson <і Coons (1954), а також Liu (1955), що показали переважно ядерну локалізацію флюоресценції, обумовлену NP-ан-антигеном в заражених вірусом грипу клітинах. Згодом цей метод широко використовувався при вивченні розподілу антигенів вірусу грипу в різні терміни циклу репродукції вірусу. Маепо і Kilbourne (1970) описали розподіл NP, гемаглютиніну та нейрамінідази. Oxford і Schild (1974) вивчили розподіл всіх чотирьох головних антигенів вірусу, в тому числі М-білка.

Спроби титрування вірусу грипу в культурі клітин з використанням техніки флуоресціюючих антитіл були зроблені Oxford і Schild (1968), описавши методику "підрахунку інфекційних центрів для оцінки кількості флюоресцирующих клітин.

Dimmock (1969) виявив-присутність вірусспеціфіче-скаго антигену в ядерцях клітин, заражених вірусом грипу. Антиген може (бути виявлений за допомогою методу ФА при використанні сироваток заражених мишей, але несивороток, приготованих проти вірусних частинок. Флюоресценція в ядерцях з'являлася в ранніх стадіях інфекції і була, на думку автора, обумовлена ??вірусним антигеном, що накопичується В 'заражених клітинах, але не включающимся в вірусні частки.

Метод ФА вельми чутливий 'І дозволяє визначати,

малі. кількості антигену або антитіл, але він може давати

неспецифічне фарбування, тому контрольні препа

рати строго обов'язкові. Для виявлення певних:

антигенів необхідно попользовать високоспеціфічеокіе антисироватки, отримані шляхом імунізації очищеними. антигенами.

Техніка радіоактивної мітки широко застосовувалася для виявлення внутрішньоклітинних вірусних білків при репродукції вірусу грипу. Becht (1969) використовував мітку радіоактивними попередниками і авторадіографію для того, щоб показати переважно ядерну локалізацію NP. Інші автори '(Joss et al., 1969; Taylor et al., 1969; Ske-hel, 1972) використовували радіоактивну мітку і ПААГЕ. Ці дослідження будуть детально описані далі, а тут про них буде лише згадано. Одним з найбільш результативних методів було застосування 358-метіоніну, який ефективно включається в вірусні білки. Skehel (1972), застосувавши цей метод, виявив синтез 9 поліпептидів в клітинах, заражених вірусом грипу. Сім з них відповідають відомим структурним поліпептидам вірусу. Два поліпептиду (8 і 9) не можуть бути ототожнені із структурними компонентами вірусу; вони були полічені вірусзакодірованнимі продуктами, не включає в вірусні частки. Ці компоненти виявляються незабаром після зараження (Skehel, 1973), але їх значення для інфекційного процесу невідомо.

Такі методи, як мітка іммуноферрітівом з подальшою електронною мікроскопією, не дали істотних результатів при спробах ідентифікації внутрішньоклітинних антигенів у клітинах, заражених вірусом грипу. Одним з головних перешкод тут було неелеціфіческое зв'язування іммуноферрітіна з білками кленкі. Ці методи, однак, були успішно іспользова'ни для ідентифікації вірусних антигенів на поверхні клітини.

б) Вірусні компоненти на поверхні клітини. Техніка гемадсорбції (Had), запропонована Vogel і Shelokov (1957), є чутливою для виявлення гемаглютиніну на поверхні інфікованої клітини. При цьому методі еритроцити морських свинок, курчат або людини вносять в інфіковану культуру клітин, яку потім промивають і інкубують в середовищі, що не містить сироватки. Наявність вірусу визначають по присутності груп еритроцитів, пов'язаних на поверхні клітинного шару. Слід використовувати такі еритроцити, які агглютинируются даним вірусом. Найбільш широко для (гемадсорбції використовували культуру клітин нирок мавп і телят. Культура клітин курячого ембріона може бути застосована для деяких штамів вірусів хрипкий типу А птахів. Had є корисним і чутливим методом для виявлення вірусної інфекції, але слід мати на увазі; можливість контамінації культур темагглютінірующімі агентами, наприклад віз-

ливість присутності вірусу SV5 в культурі клітин нирок мавп. Крім того, старі еритроцити неспецифически адсорбуються на клітинах нирок в культурі (Dowdle, Robinson, 1966). Had широко застосовується в якості методу титрування інфекційності вірусу грипу. Слід зазначити, що штами, що проходять неповний цикл реплікації, в деяких клітинах господаря можуть тим її 'Менш викликати Had в цих культурах.

Синтетичний хромогенний субстрат нейрамінідази 2 - (3-метокеіфеніл)-N-ацетілнейраміновой кислота (MPN) (Tuppy, Palese, 1969) знайшов застосування для визначення активності нейрамінідази в культурі при реплікації вірусу грипу. Palese і співавт. (1970) вдалося ідентифікувати фокуси розмноження вірусу в одношарової культурі за допомогою додавання MPN я діазоніевой солі 4-аміно-2 ,5-ді-метокси-4 /-нітроазО'бенз. Ала. Ці фокуси забарвлювалися в червоний колір, оскільки 3-метоксіфенол, звільняється з MPN під дією NA *, реагував з діазоніевой сіллю, даючи червоне забарвлення. Фокуси активності NA *, тобто осередки розмноження вірусу, могли бути виявлені цим методом навіть при відсутності локального цитопатического ефекту.

Цей метод може бути використаний при вивченні генетики. Palese і Schulman (1974) за допомогою MPN-хромофорного методу ідентифікували два типи інфекційних вогнищ в одношарової культурі лінії клітин 'Кон'юнктиви людини, зараженої клонованою рекомбінантов вірусу грипу. Були виявлені яскраво і слабоокрашенниє ділянки, що відповідають двом генетично різним компонентами вірусної популяції, які мають відповідно високе і низьке співвідношення активностей NA * і НА *.

Метод ФА нерідко використовується для виявлення антигенів вірусу грипу на поверхні / клітин. Необхідно, щоб при цьому оболонка клітини не ушкоджувалася, що запобігає проникненню в клітину реагентів. Rutter і Mannweiler (1973) описали появу вирусспецифических антигенних детермінант на (поверхні клітин HeLa, заражених вірусом грипу; при цьому використовували непряму иммунофлюоресценцию і нефіксовані клітини. Флюоресценції виявивши а ля на поверхні клітин через 4 год; після зараження; через 8 год вона досягала максимуму . Oxford (ПП) виявив інтенсивне свічення на поверхні заражених клітин MDBK та первинної культури клітин нирки теляти при використанні антисироваток проти очищених NA * і НА *. На підставі отриманих даних неможливо було з достовірністю говорити про різному розподілі цих антигенів на поверхні клітини, хоча флюоресценція при використанні сироватки: проти темаглютініна була сильнішою, ніж при використанні антінейра-мінідазной сироватки, що, мабуть, вказує на більшу кількість НА на поверхні клітини в порівнянні з кількістю NA. Хоча Rutter і Mannweiler виявили «полярне» скупчення антигенів вірусу грипу на одній стороні клітини, в дослідах Oxford; та НА * і NA * були розподілені рівномірно.

Для визначення антигенів вірусу грипу на поверхні заражених клітин за допомогою електронної мікроскопії Morgan і співавт. (1961) використовували іммуноферрітіновий метод із застосуванням протигрипозної сироватки, кон'югі-рова з феритином. Подібні методи можна застосовувати і для специфічної цдентіфікаціі антигенів на поверхні клітин при використанні антисироваток проти очищених вірусних антигенів: НА *, NA *, NP і білка мембрани ..

в) Вірусні компоненти, що звільняються з клітин. Звільнення синтезованих вірусних частинок з поверхні заражених клітин здійснюється шляхом «брунькування» на: протягом тривалого періоду, починаючи з 5-6-го години після зараження. Заражені клітини поступово дегенерують з розвитком цитопатичних змін. Крім вірусних частинок, в культуральне середовище може виходити і «розчинна» Р-антиген. За виходом вірусу і «розчинної» антигену можна стежити, визначаючи наявність вирусспецифических компонентів у культур ал ьной рідини але біологічної активності, або по присутності вірусепеціфіческіх антигенів. Найчастіше для визначення динаміки виходу вірусу з клітин використовують тест гемаглютинації (Hirst, 1941). Визначення активності NA * застосовують для цієї щілини лише в тих випадках, коли ставиться спеціальна завдання.

Обидва етіх.теста дозволяють визначити головним чином наявність вірусних частинок. Зв'язування комплементу (РСК) часто застосовують для виявлення вірусного антигену в культур а ль-ної рідини, причому використовують антитіла до NP або антитіла до поверхневих антигенів (У-антисироватки). Можуть бути використані і антисироватки до очищеним гемагглю-Тинина і нейрамінідазі. Орі цьому виявляються як вірусні частки, так і вільні поверхневі антигени, в той врехМЯ як при використанні антитіл ок білкам NP я М виявляються в основнОхМ «розчинні» антигени, а не вірусні частки. Характеристика етих систем при визначенні біологічних властивостей вірусу і кількісному вимірі грипозних антигенів описана в гол. 12.

Інфекційні вірусні частки виявляють за допомогою того чи іншого методу титрування інфекційності. Найчастіше застосовують найбільш чутливий метод визначення кінцевої точки титрування «а курячих ембріонах .. Зараження курячих ембріонів описано в розділі II, Г цій

глави. Інфекційну 50% дозу для ембріонів (ЕІД50) розраховують за кількістю ембріонів, заражених три інокуляції кожного розведення, за звичайною формулою (Reed, Muench, 1938). Титри виражаються в ЕІД50 на 1 мл рідини. Титрування інфекційності можна проводити з використанням методу культивування фрагментів хоріон-аллантоісвой оболонки на шкаралупі (Fazekas de St. Groth, White, 1958), який описаний далі, однак цей метод менш чутливий, ніж титрування на ембріонах. Титрування вірусу можна також проводити в культурі клітин способом, аналогічним титруванню на ембріонах, але з визначенням інфікування культури по гемадсорбції, як описано раніше.

Цитопатичної ефект рідко 'використовується як показник зараження культури вірусом грипу. Ці ефекти (Pereira, 1961) варіюють в широких межах у різних штамів і на різних культурах. Оскільки вони мають звичайно характер дегенеративних змін з грануляцією цитоплазми, вакуолізацією, пікнозом ядер, зморщуванням і дезінтеграцією клітин, кінцева точка титрування не може бути визначена з точністю. Описано базофільні ци-топлазматіческіе включення в клітинах, заражених вірусом грипу А, але вони теж варіюють (Soloviev, Alekseeva, 1960). Базофільні цитоплазми а тично <кі включення часто спостерігаються також в «льотках, заражених деякими штамами вірусу грипу В (Porebska et al., 1968).

Для деяких вірусів грипу, як, наприклад для FPV або для нейротронних варіантів людських штамів NWS і WSN, визначення інфекційності може бути здійснено підрахунками бляшок в монослойной культурі клітин з використанням будь-якої з методик, описаних у розділі ІВ. При використанні методу бляшок можна знати його чутливість по відношенню до титрування на ембріонах. Для перерахованих вище штамів це співвідношення приблизно дорівнює 1: 1, але для більшості штамів, виділених у людини, і для більшості використовуваних для бляшок систем відносна чутливість низька.

Б. МЕТОД НЕГАТИВНИХ КОЛОНІЇ [бляшками]

Здатність вірусів грипу до утворення бляшок широко варіює. Багато віруси не утворюють бляшок, а ті, які утворюють, мають досить низьку ефективність бляш-кообразованія, особливо віруси грипу А. Здатність до утворення бляшок є індивідуальний ознака штаму незалежно від приналежності до того-чи іншого серотипу.

Було описано утворення бляшок в первинних культурах фібробластів (Simpson, Hirst, 1961), легень (Granoff, 1955) і нирок (Wright, Sagik, 1958) журіносго ембріона. Фіб-робластах курячого ембріона успішно використовувалися головним чином в роботі з нейротропним штамом NWS і з кількома багаторазово пасеровані лабораторними штамами вірусів грипу типів А і В. Навпаки, клітина нирок курячого ембріона є непоганою системою для отримання бляшок з багатьма штамами вірусів грипу типу A (Beare , Keast, 1974).

Освіта бляшок деякими вірусами грипу А і В у монослое клітин курячого ембріона можна підсилити обробкою клітин ферментами: панкреатином (Came et al., 1968) або трипсином (Tobita, Kjlbourne, 1974). Механізм дії цих протеолітічеокіх ферментів неясний. Можливо, що вони модифікують поверхню клітини, роблячи її більш чутливою до адсорбції і проникненню вірусу,, або ж руйнують якийсь ингибирующий фактор, асоційований з кліткою або залишається після видалення середовища росту, містить сироватку.

Клітини почак сирійського хом'яка були описані в якості системи, високочутливої ??до вірусів грипу А (Grossberg, 1964), причому віруси утворювали бляшки без 'попередньої адаптації. Надалі, проте, про будь дослідах, проведених з цими клітинами, не повідомлялося,

Дві системи найбільш широко застосовувалися для бляшко-освіти з різними вірусами. Грипу: первинні культури клітин нирок мавп і бичачих почак. 'Більшість штамів вірусів грипу типів А і В, виділених і пасеровані на інших господарях, не утворюють бляшок на клітинах нирок мавп, проте багато штами можуть' бути адаптовані і починають утворювати бляшки після декількох пасажів (Henry, Youngner, 1957; Choppin, 1962) . Було висловлено припущення (Takemoto, Fabish, 1963), що неефективне бляшкоутворення вірусами грипу типу А обумовлено гальмуванням адсорбції вірусу на клітинах, що викликається Сульфатовані полісахаридами агару. У деяких штамів кількість і розмір бляшок значно увеличи-. валися при додаванні ДЗАЕ-декстрану в агар для зв'язування інгібіторів. Цей інгредієнт зараз використовується як: складова частина агарового шару в більшості систем.

Клітини нирок теляти, як зазначав ще Lehmann-Grube:

(1963) і недавно підтвердили Веаг і Keast (1974), являють

ся високоефективною системою для бляшкоутворення, ви

званого вірусом грипу В. Однорідність результатів,

отриманих з різними штамами грипу В, контрастує

з широко варьирующими результатами, одержуваними з раз

вими штамами вірусів грипу А. Про необхідність адап

тації вірусу грипу А для отримання бляшок в культурі

бичачих нирок достовірних даних немає.

З цих двох культур клітини 'нирок мавп володіють кращими якостями щодо зростання і здатності переносити лабораторні. Маніпуляції. Клітини 'бичачих нирок добре ростуть, wo легко відокремлюються від скла після утворення' помилки моношарами.

Усі первинні культури «льоток мають загальний недолік - вони неоднорідні за складом і,-крім того, чутливість до вірусів може сильно 'відрізнятися в культурах, отриманих від різних особин. Деякі клітини (особливо «льотки нирок мавп і бичачих нирок) нерідко виявляються жонтаминированнымипосторонними агентами. В 'принципі ці перешкоди можуть бути усунені при роботі з ге-тероплоідной лінією клітин. Варіант Wong-Kilbourne лінії клітин Чанга (клітини кон'юнктиви людини) був успішно використаний для бляшкоутворення з вірусами грипу А і В ((Sugiura, Kilbourne, 1965). На клітинах цієї лінії утворюють бляшки і штами вірусу грипу типу A (H3N2) з клінічного матеріалу (Rytel, Sedmak, 1973). Хоча пасаж через гетероплоідную лінію клітин робить вірус непридатним для вивчення на людях або для живої вакцини, ці дані мають істотне значення для генетичних досліджень і серологічних тестів.