Картирование по времени переноса маркеров

Последовательное поступление бактериальных генов из Hfr в F- клетки предоставляет возможность картировать их в соответствие с порядком и временем их попадания в клетки. Для этого используют метод прерванной конъюгации, разработанный Ф.Жакобом и Э.Вольманом.

При данном методе картирования в скрещивание берутся штаммы Hfr с известным расположением точки начала переноса хромосомы. В качестве селективного выбирается наиболее проксимальный маркер, входящий в реципиентную клетку первым. Антиселектором должен быть маркер наиболее удаленный от селектора.

Например: в скрещивании штамма Hfr, маркеры которого передаются в порядке АВСDе, со штаммом F- abcdЕ маркер А должен быть селектором, а антиселектором – Е.

Скрещивание начинают со смешивания культур донора и реципиента в соотношении 1:10 в момент времени t = 0. Через последовательные интервалы времени, например, через 2, 3, 5 или 10 минут, из смеси отбирают пробы и сильно встряхивают их для разрушения конъюгационных мостиков. Затем каждую пробу высевают на плотную среду, селективную в отношении признаков А и Е, но неселективную в отношении всех остальных (т.е. В, С, D). На такой среде не вырастут клетки донора и реципиента, но будут способны расти все рекомбинанты, получившие маркер А от донора. Отобранные рекомбинанты АЕ далее пересевают методом отпечатков на различные диагностические среды с тем, чтобы определить генотипы этих рекомбинантов по неселективным маркерам. Подсчитывают титры рекомбинантов каждого типа (Bcd, BCd, BCD и т.п.) для каждого промежутка времени прерывания по отношению к титру Hfr в начале скрещивания. Частота рекомбинантов каждого типа откладывается на графике как функция продолжительности скрещивания. При определении времени вхождения маркеров решающее значение имеет только самое начало кривой. Экстраполяция частоты каждого маркера к нулю указывает время попадания маркера в F- клетку. При этом точные значения легче получить для тех маркеров, которые передаются раньше, чем для маркеров, передаваемых позднее. Поэтому желательно, чтобы исследуемый маркер передавался в течение первых 20-30 минут переноса.

Используя ряд штаммов Hfr, различающихся по месту встраивания F-фактора и, следовательно, по началу и порядку переноса маркеров, можно построить полную генетическую карту, на которой, расстояния между маркерами выражены в минутах. Генетическая карта E. coli, построенная с помощью данного метода при 37°С, содержит 90-100 минут и хорошо согласуется с физическим распределением генов на кольцевой хромосоме. Карту можно растянуть, если выдерживать конъюгационную смесь при пониженной температуре.

Пример: скрещивание Hfr Thr+Leu+Azi^sTon^sLac+Gal+Str^s

F- Thr-Leu-Azi^rTon^rLac-Gal-Str^r

селекторы: Thr+Leu+, антиселектор: Str^r

Получены следующие результаты (Жакоб, Вольман, 1962):

Частота соответствующих аллелей откладывается на графике как функция от продолжительности скрещивания (рис. 17).

Рис.17. График зависимости доли неселективных маркеров среди отобранных рекомбинантов Thr+Leu+Str^r от продолжительности конъюгации.

Результаты показывают, что различные неселективные маркеры Hfr, становятся способными к рекомбинации с хромосомой F- клеток по истечении различного времени от начала скрещивания. Экстраполяция частоты каждого маркера к нулю указывает время попадания маркера в F- клетку. Из приведенных кривых можно сделать вывод, что порядок генов следующий: azi-ton-lac-gal. Расстояние между генами при данном способе картирования оценивается в минутах и между генами ton и lac оно составляет около 8 минут.