Картирование бактериальных генов при конъюгации

При конъюгации происходит постепенный перенос хромосомы до-норной (мужской Hfr) клетки в реципиентную (женскую F-), причем этот процесс может прерваться в любой момент и в реципиентной клетке оказывается лишь та часть хромосомы донора, которая успела к этому моменту в нее проникнуть. Поэтому вероятность рекомбинации между маркерами зависит не только от расстояния между ними, но и от расположения их на хромосоме по отношению к точке начала переноса.

В связи с этой особенностью генетические карты участков бактериальных хромосом могут быть построены при конъюгации двумя независимыми способами: первый способ основан на учете частоты вхождения маркеров, а второй – на учете частоты включения их в реципиентную хромосому, т.е. на учете истинной частоты рекомбинации (кроссинговера).

Первый способ выполняется двумя методами: 1. Картирование по времени переноса маркеров; 2. Картирование по градиенту переноса маркеров. Эти методы пригодны только для ориентировочного картирования (градиент передачи) или для локализации генов, расположенных не менее чем на расстоянии 1-2 мин генетической карты (картирование по времени переноса).

Для тонкого генетического картирования используют второй способ (рекомбинационный), заключающийся главным образом в анализе соотношения частот различных классов рекомбинантов в двухфакторных и трехфакторных скрещиваниях. Этот метод позволяет локализовать гены, которые расположены не далее 3 минут карты, или определить относительное расположение мутаций в пределах одного гена.

Конъюгационные скрещивания проводят путем совместного культивирования штамма-донора со штаммом-реципиентом на плотных или жидких средах. Общим условием конъюгационного скрещивания является выбор признаков донора и реципиента, по которым будет проводиться отбор редко возникающих рекомбинантов из смеси родительских клеток (селективных маркеров), и признаков, по которым будет вестись учет расщепления мерозигот (неселективных маркеров). Причем селективный маркер реципиента принято называть селектором, а селективный маркер донора – антиселектором или контрселектором. По сути, селекция и контрселекция – это просто разные названия одной и той же процедуры. В качестве селективных чаще используют маркеры ауксотрофности и высевают конъюгационную смесь на среду, не содержащую необходимого фактора роста, для контрселекции часто используют антибиотики или фаги, к которым чувствителен донор. Желательно использовать маркеры с низкой частотой реверсий.

Например: в скрещивании Hfr Thr+Leu+Рrо+Str^S х F-Thr-Leu^-Рго^-Str^R после высева смеси на минимальную среду с добавлением лейцина (leu), пролина (рrо) и сгрептомицина (str) на ней не вырастут клетки реципиента, так как они нуждаются в отсутствующем в среде треонине (thr), и клетки донора, так как чувствительны к стрептомицину. Вырастут только реципиентные, клетки, получившие маркер Thr+ от донора (рекомбинанты Thr+Str^r). В данном примере признак треонинзависимости реципиента используется в качестве селектора, а в качестве контрселектора – чувствительность донора к стрептомицину. Признаки Leu+ и Pro+, по которым отличаются донор и реципиент, будут неселективными, так как использованная среда не позволяет различать аллели этих генов. Их можно применить для анализа рекомбинационного процесса.