Принципы гибридизации и особенности рекомбинационного анализа бактерий

Основным подходом в изучении генотипа любого организма является гибридизация и количественное изучение наследования родительских свойств в ряду поколений (гибридологический анализ), любой из описанных механизмов генетического обмена может быть использован для изучения генетической организации бактериальной хромосомы, т.е. определения последовательности расположения генов и расстояния между ними. Так как картина наследования признаков определяется уровнем организации живых форм, способом их размножения и методом проведения гибридизации, то при проведении гибридологического анализа у бактерий необходимо выполнять как его общие принципы, так и учитывать своеобразие способов гибридизации.

Для получения рекомбинантов, совмещающих признаки родителей, у бактерий:

- при конъюгации используют метод совместного культивирования двух штаммов (в жидкой или на твердой средах);

- при трансформации – метод обработки клеток одного штамма препаратом ДНК, выделенной из другого штамма;

- при трансдукции – метод обработки клеток одного штамма фаголизатом, полученным при размножении трансдуцирующего фага на другом штамме.

В любом случае эти процедуры называют скрещиваниями.

Согласно общим принципам гибридологического анализа в скрещивание необходимо вовлекать изогенные культуры одного вида. Известно, что внутривидовые скрещивания происходят легче и более плодовиты. Своеобразие бактериальных скрещиваний заключается в том, что работа проводится не с индивидуальными особями, а с культурами микроорганизмов, содержащими множество отдельных особей. Только работая с клоновыми (изогенными) культурами можно получить объяснимые результаты.

В скрещивание необходимо вовлекать штаммы, различающиеся по ряду стабильных маркеров. Признаки необходимо подбирать таким образом, чтобы можно было регистрировать даже очень редко появляющиеся гибриды и рекомбинанты.

Особенность генетической рекомбинации у бактерий, имеющая важное значение для генетического анализа, состоит в относительной редкости генетической рекомбинации в скрещиваемых бактериальных культурах. Частота событий рекомбинации находится в пределах сравнимых с частотой спонтанных мутаций. Поэтому, за редким исключением, необходимо применение методов селекции рекомбинантов из большой популяции клеток родительских типов. Поэтому наиболее удобной является маркировка родителей такими признаками, которые позволяют проводить автоматический отбор рекомбинантов из массы родительских клеток (ауксотрофность, устойчивость к фагу или антибиотикам). Признаки, используемые для отбора рекомбинантов из массы родительских клеток, называют селективными или селекторами. Использование множественно маркированных штаммов гарантирует, что колонии возникают именно в результате рекомбинации, а не вследствие обратных мутаций. Если штамм, ауксотрофный по одной аминокислоте, ревертирует к дикому типу с частотой 1х10^-6, то появление колоний дикого типа можно расценить как результат реверсии или как результат рекомбинации. Если же мутант ауксотрофен по двум аминокислотам, то частота реверсии к дикому типу должна составлять 10^-6 х 10^-6 = 10^-12. Если на минимальной среде после высева смеси выросло 10^-5 прототрофных колоний, т.е. намного чаще, то с уверенностью можно говорить об их рекомбинационном происхождении.

При соблюдении этих условий обнаружение гибридизации будет свидетельствовать о том, что у данного вида или его штаммов возможен обмен информацией.

Своеобразие продуктов гибридизации бактерий – мерозигот – вносит и некоторые особенности в рекомбинационный анализ. В отличие от гибридизации у эукариот здесь невозможно определить исходное число образовавшихся зигот. Вследствие этого возникает затруднение с нормировкой вероятности рекомбинации. Единственный доступный способ – это измерение фракции рекомбинантов определенного типа относительно другой рекомбинационной фракции. Однако общие принципы рекомбинационного анализа сохраняются – чем ближе гены расположены друг к другу, тем меньше вероятность кроссинговера между ними, и вероятность четверного кроссинговера на каком-либо участке меньше, чем двойного.