Рекомбинационный анализ

Если фрагмент хромосомы донора проник в клетку-реципиент, то вероятность рекомбинации на различных участках уже не имеет градиента переноса и зависит только от частоты включения маркеров в хромосому реципиента в результате кроссинговера. Размеры включающихся фрагментов, как правило, малы. Включение идет нереципрокно и, как отмечалось выше, жизнеспособные рекомбинанты образуются только за счет двойного кроссинговера, происходящего по краям включающегося участка ДНК донора.

Для проведения рекомбинационного анализа необходимо выровнять в условиях все образующиеся в скрещивании мерозиготы. Поэтому в отличие от первых двух методов картирования в качестве селектора используют дистальный маркер (наиболее удаленный от точки начала переноса). Эта процедура гарантирует участие в конъюгации всех интересующих нас маркеров.

Например: в скрещивании Hfr, маркеры которого переносятся в порядке AВСDе, с F- аbсdЕ, селектором должен быть маркер D, а контрселектором – Е.

После скрещивания, не прерываемого во времени, смесь донорных и реципиентных клеток высевают на среду, селективную для позднопереносимого маркера донора (не содержащую фактора D) и неселективную для всех остальных маркеров, расположенных между точкой начала переноса и селектируемым маркером (т.е. содержащую вещества А, В, С и фактор-антиселектор). Наиболее дистальный маркер (Е) используется для контрселекции клеток донора. На такой среде не будут расти клетки родительских штаммов: донор не вырастет, так как чувствителен к фактору-антиселектору, реципиент не вырастет, так как в среде отсутствует вещество D. Вырастут рекомбинанты, получившие от донора маркер D, а так как он был перенесен в последнюю очередь, то и все остальные проксимальные маркеры.

Отселектированные рекомбинанты перепечатывают на ряд диагностических сред для идентификации неселективных маркеров и установления генотипа рекомбинантов. Частота появления неселективных маркеров у отобранных рекомбинантов используется для определения расстояния на карте от неселективного маркера до маркера селектора. Вследствие того, что исходное число мерозигот неизвестно, как уже отмечалось выше, единственно доступным способом определения частоты рекомбинации между маркерами (процент кроссинговера = расстоянию между генами) является определение частоты рекомбинантов одного типа относительно частоты рекомбинантов другого типа. Расстояние измеряется процентом кроссинговера.

Рекомбинационное картирование осуществляют в двухфакторных и трехфакторных скрещиваниях, причем двухфакторные используют для установления относительного расстояния между двумя маркерами, трехфакторные – для установления порядка расположения трех маркеров относительно друг друга. Рекомбинационное картирование удобно лишь при малых расстояниях между исследуемыми локусами, поскольку маркеры, удаленные друг от друга более чем на 3 минуты, расщепляются практически независимо, т.е. ведут себя как несцепленные гены.