Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза

Принцип метода: в электрическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором ацетатцеллюлозной пленке со скоростью, зависящей от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц.

Белки сыворотки крови разделяются на пять основных фракций, содержание которых определяется фотометрически.

Исследуемый материал: сыворотка крови.

Реактивы:

1. Буферный раствор pH = 8,6

2. Краситель пунцовый красный, бромфеноловый синий

3. Раствор 0,01 н гидроксида натрия

4. 3% раствор уксусной кислоты

Оборудование: ФЭК, кюветы толщиной 1 см.

Ход работы:

1. Смочить ацетатцеллюлозную пленку буферным раствором путем медленного погружения ее в буфер, с целью удаления пузырьков воздуха из пор мембран.

2. Осторожно, держа за края, вынуть пленку из буфера, промокнуть фильтровальной бумагой, чтобы удалить избыток буферного раствора.

3. Равномерно натянуть пленку между кюветными отделениями камеры так, что ее концы были погружены в буферный раствор.

4. С помощью аппликатора, на заранее отмеченные у катода участки пленки нанести сыворотку

5. Закрыть камеру крышкой и включить прибор. Время электрофореза составляет 30-40 минут.

6. По окончании электрофореза отключить прибор, вынуть пленку из камеры и постепенно погрузить ее в краситель, для фиксации белковых пятен.

7. Полученную электрофореграмму промыть 3% раствором уксусной кислоты с целью удаления несвязавшегося с белком красителя.

8. Электрофореграмму сканируют прибором. Полученная кривая позволяет судить о числе фракций и о содержании в них белка. С помощью интегрального устройства происходит количественная обработка картины разделения фракции белков, осуществляемая в автоматическом режиме.

В случае проведения электрофореза на хроматографической бумаге необходимо:

1. После проведения электрофореза осторожно вынуть бумагу из камеры, держа ее за края, уложить на рамку и высушить в сушильном шкафу при температуре 100-110 градусов Цельсия. Для фиксации белковых пятен осторожно опустить полоску в краситель.

2. Извлечь краситель из окрашенных белковых фракций.

2.1. Разрезать полученную электрофореграмму на участки, соответствующие отдельным функциям

2.2. Каждый участок электрофореграммы измельчают, помещают в отдельные пробирки и приливают: в пробирку с альбуминовой фракцией 10 мл 0,01н раствора гидроксида натрия, в пробирки с другими фракциями — по 5 мл 0,01н раствора гидроксида натрия.

2.3. Экстрагируют белковые фракции путем встряхивания пробирок в течение 10 минут. После чего фильтруют через воронку с бумажным фильтром.

3. Измеряют оптические плотности полученных фильтров на ФЭКе против холостой пробы — 0,01н раствора гидроксида натрия в кюветах толщиной 1 см при длине волны 540нм (зеленый светофильтр).

4. Рассчитывают процентное содержание каждой фракции в сыворотке исходя из их оптической плотности путем составления пропорции.

Определение содержания альбумина в сыворотке крови по реакции с бромкрезоловым зеленым (БКЗ)

Реактивы:

1. Рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере

2. Дистиллированная вода

3. Сыворотка

4. Стандартный раствор альбумина, 50 г/л

Оборудование: дозаторы, фотоэлектроколориметр, кюветы с толщиной слоя 1 см.

Принцип метода: при взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым (БКЗ) в слабокислой среде в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс зеленого цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию альбумина.

Ход работы: подготовить для исследования три пробы: холостая, контрольная, опытная согласно схеме:

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, избегая образования пены, инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 минут.

Измерить оптическую плотность контрольной (E_к) и опытной (Е_оп) проб против холостой пробы при длине волны 630-690 нм в кювете толщиной 1 см. Результаты значения оптической плотности записать в дневник и произвести расчет концентрации альбумина в сыворотке крови по формуле: С_оп = (E_оп / Е_к) * С_ст. Норма содержания альбумина в сыворотке крови 35-50 г/л.