ВВЕДЕНИЕ 3 страница

Признаки размножения вируса в курином эмбрионе

Обнаружить вирус в курином эмбрионе можно по следующим признакам. Во-первых, это гибель куримого эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Во-вторых, иногда, даже если гибели зараженного эмбриона не происходит, при вскрытии его обнаруживаются патологоанатомические изменения, появляющиеся в различных структурах эмбриона. Поражения ХАО в виде отечности, кровоизлияний, узелков (оспин) наблюдают при заражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими. Размер и морфология оспин могут заметно различаться при размножении разных вирусов. Кроме того, патологоанатомические изменения наблюдаются в самом зародыше: он может отставать в росте и развитии от незараженных (феномен карликовости), обезвоживаться и мумифицироваться, у него характерно перекручивается шея. Эти изменения в зараженном эмбрионе проявляет вирус инфекционного бронхита кур. Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями. Изменения могут наблюдаться и во внутренних органах: набухшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень зародыша является результатом действия вируса гепатита утят. Некоторые вирусы, размножаясь в курином эмбрионе, не вызывают ни их гибели, ни патологических изменений в органах. Такие вирусы, если они обладают способностью агглютинировать эритроциты, можно обнаружить при помощи реакции гемагглютинации (РГА).

Вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала

С целью обнаружения признаков размножения вируса в эмбрионе и получения вируссодержащего материала эмбрион вскрывают, соблюдая правила асептики. Перед вскрытием скорлупу эмбриона обрабатывают йодированным спиртом или фламбируют. Вскрытие проводят в боксе, пользуясь стерильными инструментами и посудой. Скорлупу срезают над той воздушной камерой, через которую заражали. Яйцо необходимо держать под наклоном, чтобы скорлупа не лопала вовнутрь. Ножницы не должны касаться и повреждать оболочку под воздушной камерой. Вируссодержащим материалом могут служить те структуры эмбриона, где накопился вирус - ХАО, ткани зародыша, стенки желточного мешка, аллантоисная и амниотическая жидкости.

ХАО осматривают, особенно ту часть, на которую провели заражение. В качестве вируссодержащего материала эту часть ХАО вырезают или берут всю ХАО. Для этого зародыш, желток и белок удаляют, а ХАО отслаивают от внутренней поверхности скорлупы, извлекают в стерильную чашку Петри, где ополаскивают её с физиологическим раствором и расправляют в один слой. Осматривать лучше на черном фоне, так более отчетливо видны патологоанатомические изменения.

Аллантоисная и амниотическая жидкости представляют собой готовую суспензию вируса. Аллантоисную жидкость до 10 мл отсасывают пипеткой, которой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша. Амниотическую жидкость (до 1 мл) можно собрать, удалив аллантоисную жидкость. Пипетку вводят при этом в амнион между головой и телом зародыша.

Стенки желточного мешка получают путем извлечения желтка, разрезания его стенки и ополаскивания его в чашке Петри с физиологическим раствором. Тело зародыша извлекают пинцетом за шею.

Весь полученный вируссодержащий материал подвергают бактериологическому контролю путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. Хранят при температурах минус 25°С или ниже.

Самостоятельная работа студентов.

1. Изучить строение куриного эмбриона по схеме.

2. Провести овоскопирование КЭ.

3. Работая в парах, студенты заражают КЭ одним из способов.

4. Работая в парах, студенты умерщвляют охлаждением и вскрывают куриный эмбрион через 5-7 дней после заражения.

5. Отбирают патматериал, извлекают и рассматривают ХАО, отбирают оболочки КЭ, отсасывают амниотическую и аллантоисную жидкости. Делают мазки из патматериала, замораживают вируссодержащий материал для дальнейших исследований.

Занятие 11-12. Культивирование вирусов на культурах клеток

Цель занятия: изучить виды и методики получения культур клеток, получить первично трипсинизированную культуру клеток из тканей КЭ.

Оборудование и материалы: методические указания по теме «Культивирование вирусов в клеточных культурах», растворы Хенкса и Эрла, питательные среды 199 и Игла, гидролизат лактальбумина, матрасы, флаконы, 9-12 дневные КЭ, лабораторная посуда, трипсин, центрифуга, магнитная мешалка, лед, камера Горяева, овоскоп, микроскопы.

Теоретическая часть.

Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона), лучше - из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Культуры клеток - наиболее совершенная из лабораторных система для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаше всего используют для:

- первичного обнаружения вирусов и их выделения из патологического материала; - накопления вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержания вирусных штаммов в лаборатории;

- титрования вирусов;

- как тест-объект в реакции нейтрализации.

Различают следующие виды культур клеток: первично-трипсинизированные, субкультуры, перевиваемые, диплоидные, суспензионные и культуры клеток на микроносителях (сефадекс, силикагель и т.д.).

Первично-трипсинизированные культуры клеток - клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. Субкультуры получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена (трипсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. Через 2-3 суток вырастает новый монослой. Перевиваемые культуры клеток - клетки, снятые, перевитые, пассажированные из первичных клеток с повышенной активностью роста более 10 раз. Они способны размножаться вне организма неопределенно длительное время.

Диплоидные культуры клеток - клетки, стабилизированные в процессе культивирования и сохранившие в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, но имеющие ограниченные возможности пассирования (до 50 раз). Их получают также из первичных культур клеток.

Суспензионные - это культуры клеток, выращенные в свободно суспендированном состоянии. Таким образом культивируются только перевиваемые клетки. Культуры клеток, полученные методами суспензионного культивирования и формирующие монослой на микроносителях (силикагель, сефадекс), называют поверхностно-зависимые, их можно выращивать из первичных, субкультур и диплоидных клеток.

Фазы развития культуры клеток

В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла, при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3-5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7-21 дня (в зависимости от вида клеток и состава питательной среды). Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х 10). Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой). Для получения первично-трипсинизированной культуры клеток можно использовать куриные эмбрионы 9-11-дневной инкубации.

Методика получения первично-трипсннизированной культуры клеток из тканей, органов и куриных эмбрионов

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточное вещество в клетке. Перед трипсинизацией измельченную ткань 2-3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15 % раствор трипсина, подогретого до 35-37°С (соотношение ткани и трипсина 1:3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку. Трипсинизацию проводят дробно, т.е. через каждые 3-5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вращения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3-5) до полного истощения ткани.

После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при 1000 мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37°С) питательной среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3-слойный марлевый фильтр.

После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток. Успех культивирования клеток в значительной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не наблюдается образование монослоя даже при длительном культивировании. При слишком большой дозе клеток происходит интенсивная их пролиферация, и образованный слой клеток значительно раньше подвергается старению и неспецифической дегенерации. Клетки подсчитывают в камере Горяева. К 1 мл взвеси клеток добавляют равный объем 0,1 % раствора кристаллвиолетa, приготовленного на 0,1 н. растворе лимонной кислоты. После перемешивания камеру заполняют взвесью клеток и подсчитывают все клетки, имеющие ядро и неповрежденную цитоплазму; группу клеток с явными контурами считают за одну клетку.

Полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37°С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться.

Для успешного выделения вируса необходимо соблюдать следующие требования к культуре клеток:

1. Используемая культура клеток должна быть чувствительной к предполагаемому вирусу.

2. Вируссодержащий материал не должен быть старым, долго хранившимся.

3. Культивирование проводят при определенном соотношении вируса и клеток, т.е. при определенной множественности заражения.

4. Распределение вируса в монослое при заражении должно быть равномерным.

5. Оптимальная температура для размножения вируса 36-38°С.

6. Не допускать длительного нахождения образовавшегося свободного вируса в теплой среде.

7. Получать вирус лучше при 75 % цитопатического действия. Методика культивирования вирусов в культуре клеток сводится к подбору культуры клеток; заражению клеток вируссодержащим материалом, культивированию вируса в клетках с последующей индикацией (обнаружением) вируса в культуре клеток и идентификацией вируса в культуральной жидкости.

Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Успешнее всего вирус адаптируется при условии, если культура клеток получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Также для культивирования необходимо использовать молодые клетки, т.е. в первый день формирования монослоя. В некоторых случаях культуру клеток заражают при их посеве, так как вирус лучше размножается в интенсивно делящихся клетках (парвовирус свиней).

Заражение клеток

Для заражения клеток отбирают пробирки (матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1-2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. Оставляют так пробирки на 1-2 часа при 22-37°С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из пробирок, если требуется, то монослой клеток отмывают раствором Хенкса и наливают поддерживающую среду до 1-2 мл (в матрасы до 10 % его объема).

Культивирование вируса

Пробирки закрывают герметично и ставят на инкубирование в термостат 37°С в горизонтальном положении под углом 5 градусов так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). Эффективнее для культивирования использовать вращающиеся системы — роллеры.

Для каждой пробы материала используют не менее 4 -10 пробирок с культурой клеток и оставляют 4-6 пробирок контрольных - с незараженной культурой, в которые добавляют поддерживающую среду. При культивировании вирусов питательную среду можно не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9-7,4) поддерживают с помощью 7,5 % раствора бикарбоната натрия. При более длительном культивировании (аденовирусы) среду меняют.

Все пробирки после заражения ежедневно исследуют под малым увеличением микроскопа, сравнивая с контрольными. Адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь, начинается их репродукция. Образовавшиеся вирусные частицы проникают в непораженные клетки, репродуцируются в них и поражают новые клетки до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки.

Вирус накапливается в основном в культуральной жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тщательно разрушают многократным замораживанием - оттаиванием (2-3 раза) или с помощью ультразвука.

Индикация вируса в культуре клеток

Обнаружить признаки размножения и накопления вируса в культуре клеток можно несколькими методами: по цитопатическому действию или эффекту (ЦПД или ЦПЭ), по положительной реакции гемадсорбции (РГАд), по образованию бляшек, по обнаружению внутриклеточных включений, по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции (РИФ), по обнаружению интерференции вирусов, по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией и др.

ЦПД (цитопатическое действие) - любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Морфологические изменения в клетке можно обнаружить микроскопированием при малом увеличении (объектив х 8-10, окуляр х 7-10) слоя клеток в пробирке. При этом сравнивают зараженные культуры клеток с контрольными. Любые наблюдаемые отличия можно считать проявлением ЦПД.

ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому данный метод индикации вирусов в культуре клеток широко применяется. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом, и оценивается в крестах или баллах:

- изменению подвергся весь монослой ++++

- изменению подверглось 3/4 монослоя +++

- изменению подверглось 1/2 монослоя ++

- изменению подверглось 1/4 монослоя +

Время проявления и формы ЦПД зависят от биологических свойств вирусов, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация, округление и симпластообразование. Фрагментация клеток - разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).

Округление - потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы).

Симпластообразование - растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются, чаще по периферии, ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы со многими ядрами называются симиластами (гигантские многоядерные клетки).

Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому прибегают к «слепым» пассажам - их проводят не менее трех, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.

Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирус бешенства, классической чумы свиней). Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.

Самостоятельная работа студентов.

1. Получить первично трипсинизированную культуру клеток из тканей КЭ.

2. Заразить культуру клеток вируссодержащей суспензией.

3. Пронаблюдать ЦПД, вызванное вирусом в культуре клеток.

Занятие 13. Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция задержки гемагглютинации (РЗГА) в вирусологии.

Цель занятия: ознакомить студентов с принципом и методикой постановки реакций гемагглютинации и задержки гемагглютинации.

Оборудование и материалы: вируссодержащий материал, 1% и 5% взвеси эритроцитов, вируссодержащая взвесь, нейтрализующие сыворотки, полистироловые планшеты, предметные стекла, пипетки объемом 1 мл, стерильный физиологический раствор.

Теоретическая часть.

Вирусы, если они обладают способностью агглютинировать эритроциты, можно обнаружить при помощи реакции гемагглютииации (РГА). Гемагглютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепторы, способные взаимодействовать с рецепторами оболочек эритроцитов. Такие вирионы адсорбируются на поверхности одного или нескольких эритроцитов и склеивают их. При добавлении к капле отмытых эритроцитов капли суспензии гемагглютинирующего вируса, полученной от зараженного эмбриона, образуются хлопья, видимые невооруженным глазом, на поверхности стекла. В пробирке гемагглютинация будет выглядеть в виде «зонтика» осевших хлопьев эритроцитов. Положительная гемагглютинация, образовавшаяся через 5-10 минут, указывает на присутствие вируса в суспензии, а также выявляет гемагглютинируюшую активность его с определенным видом эритроцитов, что служит вспомогательным диагностическим признаком.

РГА используется для индикации вирусных антигенов, титрования вируссодержащих материалов, для ориентировочной диагностики некоторых вирусных инфекций, для очистки и концентрирования вирусов.

Для ориентировочной РГА используют чистые обезжиренные предметные стекла. На стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов и добавляют вируссодержащий материал. Компоненты тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Результаты учитывают через 5-10 минут. В положительном случае образуются зерна агглютинации, смесь в капле при этом просветляется. При отрицательном результате гемагглютинации не наблюдается, взвесь в капле остается равномерно мутной.

Классический вариант РГА ставят в пробирках или лунках полистиролового планшета. Приготавливают двукратные разведения вируссодержащего материала (от 1:2 или 1:10 до 1: 320 и выше). Во все пробирки добавляют по 0,5 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов. К опыту ставится контроль на стабильность эритроцитов: к 0,5 мл физиол. Раствора добавляют 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов. Штатив с опытными и контрольной пробирками энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре или при 4°С на 30-40 минут. Эритроциты кур оседают за 30 минут, эритроциты млекопитающих оседают медленнее, обычно в течение 1-2 часов. В эти сроки проводят учет РГА по форме образовавшегося осадка эритроцитов: # - образуется характерный осадок эритроцитов в виде перевернутого “зонтика”; +++ - менее широкий кружевной осадок, а на дне пробирки (лунки) формируется небольшое кольцо более плотно осевших эритроцитов; ++ и + - эритроциты оседают на дно пробирки (лунки) в виде плотного диска с более или менее выраженной зернистой каймой по краям;

- образуется плотный осадок эритроцитов в виде диска с ровными краями.

Титром вируса (соответствующий 1 гемаглютинирующей единице)- считается наибольшее разведение, при котором реакция агглютинации эритроцитов оценивается на ++.

Принцип реакции задержки гемагглютинации (РЗГА): при взаимодействии вирусных антигенов со специфическими антителами иммунной сыворотки происходит подавление гемагглютинирующей активности вируса, выражающиеся в торможении (задержке) феномена агглютинации эритроцитов.

РТГА применяется для идентификации и типизации вирусов, титрования вируссодержащих жидкостей и материалов, серологической диагностики вирусных инфекций.

Делают последовательные разведения сыворотки. Затем во все луночки добавляют оттитрованный вируссодержащий материал в разведении соответствующем 4-кратной концентрации его титра установленного по РГА по 0,5 мл. Панель встряхивают и оставляют при комнатной температуре 10-15 минут для взаимодействия вируса с антителами сыворотки. После этого во все пробирки вносят по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на время, различное для разных видов вирусов. Положительная реакция – отсутствие гемагглютинации в основном опыте и ее наличие в контроле. Отрицательная реакция – наличие гемагглютинации.

Наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинаиию. принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

Самостоятельная работа студентов.

1. Студенты, работая в парах, ставят РГА и РЗГА.

2. Определяют титр.

Занятие 14. Реакция гемадсорбции (РГад) и реакция задержки гемадсорбции (РЗГад) в вирусологии.

Цель занятия: ознакомить студентов с принципом и методикой постановки реакций гемадсорбции и задержки гемадсорбции нейтрализации.

Оборудование и материалы: вируссодержащий материал, однослойная культура клеток в пробирке или флаконе, 1% взвесь эритроцитов морской свинки или петуха в физиологическом растворе или растворе Хенкса (рН 7,2-7,4), физиологический раствор, раствор Хенкса, среда 199, лабораторная посуда (пробирки, пипетки и др.).

Теоретическая часть.

Гемадсорбция - это соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток, основанное на родстве рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках.

Методика реакциисостоит в том, что на 3-4 день после инфицирования клеток в пробирку с зараженной культурой клеток и контрольную, слив предварительно культуральную жидкость, вносят по 2-3 капли 0,5% суспензии отмытых эритроцитов. Выдерживают 5-10 минут, споласкивают физиологическим раствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физиологическим раствором, а в зараженной - эритроциты прикреплены к поверхности клеток, т.е. реакция положительная.

В зависимости от вируса и вида клеток, расположение эритроцитов может быть различным: либо они адсорбируются по периферии клеточной массы в виде «ожерелья» (вирус африканской чумы), либо расположены на слое клеток очагами и скоплениями (вирус гриппа), либо расположены диффузно в слое клеток (вирус парагриппа).

При отсутствии гемадсорбции на 3-4 день после инфицирования через каждые 2-3 дня берут следующие пробирки с инфицированной культурой клеток и ставят РГАд. Пробирки с культурой клеток находятся под наблюдением в течение 14-20 дней. При отрицательной реакции в первом пассаже проводят следующий пассаж и ставят реакцию.

Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов. Для постановки реакции используют эритроциты морской свинки, обезьян, человека (группы 0) и другие эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию изучаемого вируса. Метод этот пригоден для индикации в культуре клеток только некоторых вирусов и поэтому применяется нечасто. Однако для индикации ряда вирусов (парагриппа-3 крупного рогатого скота, парагриппа овец, вируса Сендай, вируса африканской чумы свиней) он незаменим.

РГад предложена для раннего обнаружения главным образом респираторных вирусов в различных патологических материалах, а также для количественного определения их содержания.

Принцип реакции задержки гемадсорбции заключается в том, что специфические противовирусные иммуноглобулины (антитела) гипериммунной сыворотки, взаимодействуя с антигенами гемадсорбирующих вирусов, развивающихся в клетках культуры ткани, блокируют их, в результате адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных не наблюдается.

РЗГад применяется для обнаружения, идентификации и типизации вирусов в зараженной культуре клеток, а также для их количественного определения.

Из пробирок с культурой клеток, инфицированных вирусом, удаляют питательную среду с помощью стерильной пипетки и отмывают клетки от белковых веществ среды, добавляя в пробирки 3-5 мл стерильного раствора Хенкса. После 1-2 минутной экспозиции раствора Хенкса удаляют из пробирок с помощью пипетки. После этого в каждую опытную пробирку вносят по 0,6 мл раствора Хенкса и 0,2 мл противовирусной сыворотки в разведении 1:10, в контрольную пробирку 0,8 мл раствора Хенкса. Пробирки фиксируют в наклонном положении (клетки снизу и покрыты: в опыте – раствором сыворотки, в контроле - раствором Хенкса) и выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 минут. Во все пробирки добавляют по 0,2 мл 0,4% взвеси эритроцитов и в наклонном положении оставляют на 3-5 минут. Пробирки 5-10 раз осторожно вращают в руках, поворачивая их вокруг вертикальной оси с целью ресуспендирования осевших, но не адсорбировавшихся эритроцитов и исследуют под микроскопом. Положительная РЗГад – эритроциты свободно плавают в жидкости без заметной адсорбции их на поверхности клеток. Отрицательная РЗГад – эритроциты адсорбированы на поверхности, инфицированных клеток.

Самостоятельная работа студентов.

1. Студенты делятся на две группы и осуществляют постановку РГАд и РЗГад.

2. Сравнивают полученные результаты.

Занятие 15. Реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и диффузной преципитации (РДП) в вирусологии

Цель занятия: ознакомить студентов с принципом и методикой постановки реакций гемагглютинации и диффузной преципитации.

Оборудование и материалы: вируссодержащий материал, диагностические сыворотки для РНГА и РДП, чашки Петри с 1% агарозой, физиологический раствор, лабораторная посуда (пробирки, пипетки и др.).

Теоретическая часть.

РДП применяется в настоящее время для диагностики вирусного гепатита плотоядных, бешенства, лейкоза КРС, инфекционной анемии лошадей и многих других болезней. По сравнению с другими серологическими реакциями эта реакция наиболее проста по технике и довольно специфична по показаниям, но несколько менее чувствительная.

Сущность реакции заключается в том, что специфические антиген и антитело, помещенные на определенном расстоянии друг от друга в агаровом геле, диффундируют в среду и в местах их встречи образуют полосы преципитации, хорошо видимые при нижнем боковом освещении на темпом фоне. При несоответствии антигена антителам (в отрицательных случаях) полосы преципитации не образуются.

В РДП участвуют два компонента - антиген и сыворотка (антитело), проходит реакция в агаровом геле в присутствии в качестве электролита физиологического раствора хлористого натра.

Для постановки реакции заранее готовят 1%-ный агаровый гель из высоко очищенных сортов агара. Лучше использовать агар Дифко, который в такой концентрации дает прозрачный гель, позволяющий четкой хорошо видеть полосы преципитации. Для приготовления агарового геля берут на литр дистиллированной воды 10 г агара Дифко, 8,5 г хлористого натрия и нагревают в кипящей водяной бане до пол- ного расплавления агара. Затем добавляют в качестве консерванта мертиолат 0,1 г или кристаллическую карболовую кислоту 5,0 г. В горячем виде разливают по флаконам по 50-100 мл, стерилизуют автокла- вированием при 0,8-1 атм. 20 минут (или в кипящей бане 30-40 минут) и хранят под резиновой пробкой до употребления, чтобы не было высыхания среды. Для увеличения контрастности среды иногда добавляют метилоранж (5:100.000). Другие сорта агара требуют предварительного их осветления. Для этого вначале готовят из агара 2%-ный раствор на дистиллированной воде, который после расплавления в кипящей бане в горячем виде разливают в ванночки толщиной в 1-1,5 см. После застывания агаровую пластинку разрезают на кусочки размером 0,5-1,0 см, которые промывают в течение 2-3 суток проточной водопроводной водой и затем еще сутки дистиллированной водой, меняя ее за это время 3-4 раза. После промывания агар отжимают в марле и вновь расплавляют в кипящей бане и разводят в 2 раза 1,7%-ным раствором хлористого натрия на дистиллированной воде, чтобы ко­нечная концентрация агара была 1%, а хлористого натрия - 0,85%. В горячем виде раствор трижды фильтруют через бумажный фильтр (или ватно-марлевый) и после добавления консервантов разливают по флаконам и стерилизуют. В расплавленном виде агар должен быть совершенно прозрачным. В настоящее время готовый 1%-ный агар для РИД выпускают в наборе с диагностикумами при бешенстве, вирусном гепатите, лейкозе, ИНАН и других заболеваниях.