ВВЕДЕНИЕ 5 страница. 1. Получение одноцепочечного фрагмента ДНК определенного вируса -ДНК-зонда и его метка.

1. Получение одноцепочечного фрагмента ДНК определенного вируса -ДНК-зонда и его метка.

Для каждого вида вируса зонд готовят заранее: нарабатывают его, вводят в него радиоактивную метку или биотин, дающий изменения цвета, позволяющую обнаруживать зонд и соединившуюся с ним нуклеиновую кислоту. Хранят зонд до использования. Для получения зонда из материала от больного животного выделяют вирус, на который хотят получить ДНК-зонд. Методом электрофореза выделяют фрагмент ДНК вируса. Внедряют фрагмент ДНК вируса в ДНК бактерии (плазмиды) и клонируют в селективной среде, накапливая массу бактерий. После накопления из бактерий выделяют плазмидную ДНК с вирусными вставками, метят ее и денатурируют путем нагрева 80°С. что приводит к разделению двухцепочечной ДНК на одноцепочечные, имеющие фрагменты, комплементарные фрагментам одной из нитей ДНК вируса Это и есть зонд.

Для получения ДНК-зонда на вирусную РНК выделяют ее фрагмент, затем путем обратной транскрипции получают ДНК-фрагмент, который и встраивают в плазмиду.

С помощью ДНК-зонда можно обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты в любом материале от больных животных. Для этой цели пригоден как свежий материал (ткани, смывы, кровь), так и высушенный, мороженый и даже частично разложившийся.

2. Этап выделения из патологического материала нуклеиновой кислоты - их денатурация (расплетение двухцепочечной молекулы на одноцепочечные). Для этого патологический материал гомогенизируют, суспендируют, центрифугируют и над осадочную жидкость обрабатывают препаратами, разрушающими белки.(сначала протеиназой, затем фенолом с хлороформом). Затем осаждают ДНК при минус 70°С, осадок отмывают спиртом и подвергают денатурации путем кипячения или обработки щелочью.

3. Этап молекулярной гибридизации, т.е. процесс контакта и удвоения, исходных одно цепочечных ДНК (ДНК вируса и ДНК-зонда), если они взаимно комплементарны. Для этого полученные пробы из разных исследуемых материалов наносят на фильтр (микропористая мембрана), расчерченный на квадраты (для каждого материала свой номер квадрата). Зонд накосят на стекло, которое накладывают на фильтр с исследуемым материалом и выдерживают 20 мин при 80°С. затем еще 2 часа при 55°. Также готовят и контроля: отрицательный и положительный. Затем фильтр отделяют от стекла, промывают, сушат и удаляют с него все несвязавшиеся одноцепочные молекулы ДНК, обрабатывая его додецилсульфатом и цитратом натрия.

4. Этап обнаружения (по метке) образовавшихся двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот — проводят методом авто радиографии, выявляя радиоактивность, и сравнивая ее с контролями. Учет проводят визуально - по интенсивности потемнения фотопленки, контактировавшей с определенными квадратами. Потемнение свидетельствует о наличии в патологическом материале этих квадратов искомой нуклеиновой кислоты вируса.

Самостоятельная работа студентов.

1. Ознакомиться с методикой выделения нуклеиновых кислот при диагностике вирусных инфекций.

2. Изучить принцип работы амплификатора.

3. Освоить проведение горизонтального гельэлектрофореза.

Занятие 19. Методы титрования вирусов.

Цель занятия: ознакомить студентов с методами количественного определения вирусов.

Оборудование и материалы: задания, логарифмические таблицы.

Теоретическая часть.

Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале. Титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. В вирусологической работе при экспериментальном заражении или производстве и оценке активности противовирусных и диагностических препаратов постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Количество вируса выражают в единицах действия или единицах активности.

Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие. В практике используют три типа единиц количества вируса:

1. Инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту.

2. Инфекционные единицы 50% действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статически.

3. Гемагглютинирующие единицы.