ВВЕДЕНИЕ 4 страница

Ставят реакцию в чашках Петри или на предметных стеклах в микромодификации. При постановке реакции в чашках Петри отбирают чистые, хорошо мытые чашки с ровным дном. В чашку вносят расплавленный в кипящей бане 1%-ный агаровый гель в количестве 25-30 мл с таким расчетом, чтобы слой был 3-4 мм. После застывания агара в нем делают лунки, форма, количество и расположение которых в агаре может быть различное в зависимости от объема и цели исследования. Когда исследуют один антиген к двум сывороткам (или наоборот) готовят три лунки. При диагностике бешенства антиген (суспензия мозга) исследуют к 4 разведениям антирабической сыворотки (1:2,1:4,1:8, 1:16) и для этого готовят 5 лунок, одну из которых делают в центре, остальные четыре по периферии. При больших объемах исследований лунки часто располагают в форме шестиугольника (одна лунка в цен­тре и шесть по периферии). Таких шестиугольников можно в одной чашке Петри приготовить 6-7 и, следовательно, можно исследовать 36-42 материала. Лунки чаще всего готовят круглой формы с диаметром в 4-5 мм и располагают друг от друга и от центральной лунки на расстоянии 5-6 мм. Для удобства работы и стандартизации расположения лунок можно приготовить трафаретку, которую помещают под дно чашки в процессе приготовления лунок. Лунки удобнее всего готовить путем выдавливания агара металлической или стеклянной тонкостенной трубкой диаметром 4-5 мм с надетым на конец трубки резиновым баллончиком (груша), с помощью которого отсасывают столбик выдавленного агара. Для создания дна у лунок в каждое приготовленное отверстие затем закапывают по одной капле расплавленного агара. В приготовленные таким образом лунки затем вносят антигены и сыворотки, каждый компонент соответственно в свою лунку по 3-4 капли (до заполнения лунки). После заполнения лунок чашку ставят в термостат при 37°С и, чтобы не было высыхания агара, в чашку кладут кусочек ваты, смоченной водой.

Учет реакции проводят через 24-48 и 72 часа. Для этого чашки вынимают из термостата и просматривают на темном фоне при нижнем боковом освещении с помощью осветителя к микроскопу. В положительных случаях между лунками со специфическими компонентами появляется за счет образования преципитата серо-белая полоса преципитации, хорошо видимая на темном фоне. Располагается полоса, как правило, перпендикулярно линии мысленно соединяющей лунки со специфическими компонентами. С целью усиления видимости полос иногда проводят обработку агара с прошедшей реакцией 0,065%-ным раствором сернокислого кадмия.

С целью экономии агара и при исследовании небольших количеств материала реакцию можно ставить на предметных стеклах. Для этого расплавленный агаровый гель наносят на чистое предметное стекло с таким расчетом, чтобы слой агара после застывания был 3-4 мм. После застывания агара в нем так же, как и в чашках Петри, делают лунки и в них вносят антиген, и сыворотки. Стекло с агаром затем помещают в чашку Петри, сбоку кладут кусочек ваты, смоченной водой, и ставят в термостат при 37°С. В этом случае реакция проходит быстрее и полосы преципитации появляются уже через 18-24 часа.

Одновременно с постановкой реакции ставят контроли: стандартной сыворотки со стандартным антигеном (реакция положительная), нормальной сыворотки со стандартным антигеном и нормальной сыворотки с исследуемым антигеном (реакции отрицательные).

В последние годы при диагностике вирусных болезней все шире внедряется РНГА (РПГА), которая более чувствительная, чем прямая РГА и является специфической серологической реакцией.

Целый ряд вирусов способны адсорбироваться на эритроцитах и при этом не вызывать их агглютинацию. Если же к таким эритроцитам, сенсибилизированным антигеном, т.е. несущим на себе адсорбированный вирус, добавить иммунную специфическую сыворотку происходит агглютинация эритроцитов с помощью антител иммунной сыворотки.

В настоящее время при некоторых вирусных болезнях разрабатываются и выпускаются предприятиями биопромышленности такие эритроцитарные диагностикумы. Эритроциты для лучшей адсорбции на них вируса (или антител) предварительно обрабатывают раствором таннина путем смешивания равных объемов 2,5% взвеси эритроцитов и раствора таннина (1:200.000), затем центрифугируют и отмывают фосфатным буфером. На обработанные таннином эритрощггы затем адсорбируют вирус и получают эритроцитарный антиген, который затем и используют для исследования сывороток крови на наличие антител. С целью выявления вируса в исследуемом материале и для его идентификации и типизации применяют эритроцитарный диагностикум, сенсибилизированный специфическими антителами, т.е. несущий на себе адсорбированные антитела.

Для постановки реакции в пробирки вносят по 0,5 мл соответствующего разведения исследуемой сыворотки (при исследовании на наличие антител) и 0,1 мл взвеси сенсибилизированных вирусом эритроцитов (эритроцитарный антиген). В качестве контролей ставят параллельно реакцию с положительной и нормальной сыворотками и этим же эритроцитарным антигеном. Пробирки после встряхивания ставят в термостат или оставляют при комнатной температуре на 40-60 минут и учитывают результат. Если исследуемая сыворотка иммунная, т.е. содержит антитела, происходит агглютинация эритроцитов (положительная реакция, животное инфицировано). Эта реакция более перспективна, чем прямая, для диагностики вирусов, и особенно тех, которые сами не обладают гемагглютинирующими свойствами.

Для выявления вируса в патологическом материале используют эритроцитарный диагностикум с адсорбированными антителами. Если в патматериале содержится вирус специфичный для антител, наступает агглютинация эритроцитов.

Самостоятельная работа студентов.

1. Студенты, работая в парах, ставят РНГА и РДП.

2. Сравнивают результаты.

Занятие 16.Иммуноферментный анализ (ИФА) в вирусологии

Цель занятия: ознакомить студентов с принципом и методикой постановкииммуноферментного анализа.

Оборудование и материалы: исследуемые сыворотки, набор для проведения ИФА при лейкозе КРС, лабораторная посуда (пробирки, пипетки и др.).

Теоретическая часть.

Группа методов, основанных на использовании в качестве метки антигенов и антител ферментов, носит название иммуноферментного анализа (ИФА). Основные направления применения ИФА: ранняя диагностика болезней, проведение массовых эпидемиологических и эпизоотологических исследований, контроль качества продукции и соблюдение санитарных норм на предприятиях. ИФА используется для выявления и идентификации вируса и антител к нему (у животных - реконвалесцентов) или исследования уровня поствакцинальных антител. Для идентификации вирусоспецифического антигена иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция

Иммунопероксидазная реакция аналогична методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченые не флуорохромом, а ферментом, учет результатов реакции проводят не под люминесцентным, а под обычным световым микроскопом. В этом варианте ИФА используют антитела, меченые пероксидазой, так как ее молекулярная масса (40 000) меньше, чем молекулярная масса щелочной фосфатазы (100 000) и галактозидазы (150 000), что способствует лучшему проникновению пероксидазного конъюгата сквозь клеточную мембрану. Кроме того, пероксидаза устойчива при гистологической обработке.

Материал для выявления вирусспецифических антигенов

Материалом для выявления вирусспецифических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазной реакции могут быть: мазки-отпечатки различных органов, парафиновые среды, культура клеток, мазки крови. Использование для иммунопероксидазной реакции носоглоточных смывов несколько ограничено в связи с наличием в воспаленных клетках большого количества эндогенной пероксидазы, обусловливающей высокое фоновое окрашивание. Для инактивации эндогенной пероксидазы применяют азид натрия в сочетании с перекисью водорода и фенил гидразин. Обработку указанными реактивами проводят перед нанесением иммуноферментного конъюгата на препарат.

Иммунопероксидазную реакцию ставят в прямом и непрямом вариантах. Методика прямого метода заключается в следующем:

1) культуру клеток, выращенную на покровных стеклах и инфицированную вирусом, или мазки-отпечатки в течение 10 мин фиксируют охлажденным до минус 10 - минус 20°С ацетоном;

2) препараты высушивают на воздухе и наносят на них 0,2-0,3 мл иммунопероксидазного конъюгата в рабочем разведении, которое указано на ампуле;

3) инкубируют 1-2 часа, при необходимости - до 6 часов при 37°С во влажной камере;

4) в течение 15 мин тщательно промывают препарат физиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе;

5) наносят на него несколько капель раствора субстрата - диаминобензидинтетрахлорида;

6) инкубируют еще 5-10 мин и промывают 10-15 мин в физиологическом растворе, споласкивают дистиллированной водой;

7) учитывают результат с помощью светового микроскопа.

В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в исследуемом препарате, после нанесения иммунопероксидазного конъюгата образуется комплекс антиген - антитело, меченый ферментом. После нанесения на препарат раствора субстрата, последний под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции (голубого цвета, быстро переходящего в коричневый), хорошо видимый в световом микроскопе. В препарате видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают. Вирусо-специфический антиген в мазках и гистосрезах обнаруживают тем же способом. Однако при исследовании срезов время инкубации препарата с конъюгатом нужно продлить до 20 ч при температуре 4°С или до 6 ч при температуре 37°С.

Непрямой иммунопероксидазный тест применяют для выявления вирусспецифического антигена. Преимуществом непрямого метода является универсальность меченых антивидовых глобулинов, а также большая чувствительность по сравнению с прямым.

Методика постановки непрямого метода схожа с вышеописанным прямым методом, с добавлением после третьего пункта дополнительно обработки препарата антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом в объеме 0,2-0,3 мл и инкубирование при 37°С 1-6 ч. Далее также следуют процедуры, которые были описаны для прямого метода.

При наличии в исследуемом материале вирусспецифического антигена после внесения специфической сыворотки образуется комплекс антиген-антитело, для выявления которого используют антивидовые или вторичные антитела, меченные ферментом.

Таким образом, образуется более сложный, чем в первом случае, комплекс: антиген - антитело -вторичное антитело - фермент. Полученный комплекс выявляют добавлением субстрата, который под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции. Учет результатов проводят, как и в первом случае, в световом микроскопе.

Иммунопероксидазная реакция в прямом и непрямом вариантах используется для выявления вирусов бешенства, ящура, герпесвирусов, энтеровирусов и др.

Методы твердофазного иммуноферментного анализа

Основан на применении антител (антигенов), фиксированных на нерастворимых носителях. В качестве носителей используют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или керамические пробирки и микропанели. В последнее время широкое использование в ИФА получили полистироловые микропанели. Применение их и автоматизация процесса постановки и учета реакции позволяют за короткое время исследовать большое число образцов сывороток на наличие антител и другого материала на наличие вирусспецифического антигена. В твердофазном ИФА используют как пероксидазные, так и щелочно-фосфатазные конъюгаты. Для исследования большого числа образцов с помощью твердофазного ИФА необходимо иметь: полистироловые микропанели с плоским дном, автоматические пипетки с переменным или постоянным объемом от 50 до 200 мкл, промывочное устройство -автоматическое или полуавтоматическое и считывающее устройство.

Необходимо отметить, что анализ может быть выполнен на микропанелях и без перечисленных выше приборов. В этом случае учет результатов реакции может быть проведен визуально, без использования специальной регистрирующей аппаратуры, но в этом случае резко снижается производительность метода.

При визуальном учете при использовании субстрата ОФД положительные образцы имеют оранжево-коричневую окраску, а при применении 5-аминосалициловой кислоты опытные образцы окрашиваются в интенсивно-коричневый цвет, в то время как отрицательный контроль либо совсем не окрашен, либо окрашен в слабо-желтый цвет. При использовании щелочной фосфатазы опытные образцы окрашены в желтый цвет.

За положительный результат принимают превышение оптической плотности опытных образцов над контрольными в 5-10 раз. Автоматизированный учет - результаты, получаемые с помощью иммуноферментного теста, можно оценивать автоматически - с помощью спектрофотометрии.

Часто ценной является качественная информация о наличии или отсутствии данного соединения в исследуемой пробе. В этих случаях учет результатов ИФА можно проводить визуально, по появлению окрашенного продукта ферментативной реакции. Возможность визуальной оценки результатов крайне важна при необходимости массовых исследований вдали от стационарных лабораторных центров.

Самостоятельная работа студентов.

1. Зарисовать схему проведения прямого и непрямого ИФА.

2. Студенты, работая в парах, ставят ИФА, используя тест-системы для выявления вируса лейкоза КРС.

Тема 17. Реакции связывания комплемента (РСК) и нейтрализации (РН) в вирусологии.

Цель занятия: ознакомить студентов с принципом и методикой постановки реакций связывания комплемента и нейтрализации.

Оборудование и материалы: вируссодержащий материал, сыворотки иммунная и нормальная, панели, пипетки, физраствор, задания по вычислению индекса нейтрализации, типоспецифические ящурные сыворотки, пробирки, водяная баня, комплемент, гемолизин, 2% взвесь эритроцитов.

Теоретическая часть.

РСК используют для обнаружения вирусного антигена в инфицированных тканях и жидкостях, установления уровня антител у естественно или искусственно зараженных животных и для изучения антигенных связей между вирусами различных видов или штаммов (идентификация). Постановка РСК при вирусных заболеваниях значительно отличается от техники постановки ее при бактериальных инфекциях. Это обусловлено специфическими свойствами вирусов: облигатные внутриклеточный паразитизм, лабильность вирусных антигенов к трупному аутолизу, неравномерность фиксации комплемента при различном соотношении концентраций антигена и антител, незначительный объем комплекса антиген + антитело, неравномерное накопление вирусного антигена и антител в различные периоды болезни при разных инфекциях.

РСК выполняется в два этапа: подготовительный (приготовление антигена, титрация гемолизина, комплемента) и заключительный (главный опыт РСК).

РСК для типизации вируса ящура.

Приготовление антигена. Экстракт из оболочек афт крупного рогатого скота, приготовленный на 50% растворе глицерина в фосфатном буфере (рН – 7,6) вводят в эпителий языка здоровых животных. Чрез 24-40 часов образуются первичные афты. На этой стадии отбирают оболочку пузырьков с прилипшей к ним лимфой, измельчают ножницами, растирают со свободными от извести стерильным морским песком и заливают двойным количеством (по весу) стерильного фосфатного буфера (рН – 7,6). После этого суспензию оставляют на 2-3 часа при 4°С и центрифугируют 15 минут при 15 тыс. об/мин. Надосадочная жидкость представляет собой готовый антиген.

Титрация гемолизина. Гемолизин титруют в гемолитической системе в разведениях 1:1500, 2000, 3000, 4000 и 1:5000. Реакцию учитывают после выдерживания разведений гемолизина 10 минут в водяной бане при температуре 37°С. Титром гемолизина считают то наивысшее его разведение, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. Рабочим разведением гемолизина считается 4-кратная концентрация его предельного титра.

Титрация комплемента. Комплемент титруют в гемолитической системе и обязательно в день постановки реакции. Его используют в разведении 1:20 в следующих дозах: 0,05, 0,10, 0,15 и т.д. с интервалами 0,05 до 0,40. В каждую пробирку недостающее количество до объема 0,5мл доливают физиологическим раствором. Это будет соответствовать 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 и 4,0 % цельного комплемента, содержащегося в дозе 0,5 мл разведения с физиологическим раствором. Пробирки ставят в водяную баню на 15 минут при 37-38°С, после чего учитывают реакцию. Титром комплемента считается то наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. При определении типов вирусов ящура используют комплемент, который при указанных условиях имеет титр не ниже 2,5%. Для постановки главного опыта РСК комплемент берут с постоянным излишком в 1%.

Испытуемый антиген в реакции исследуют цельным (33% взвесь) и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8.

Для определения типа вируса главный опыт РСК ставят в объеме 1 мл по следующей схеме:

Таблица 1.

Схема главного опыта РСК.

Условные обозначения: «» - 100% задержка гемолиза. В этом случае испытуемый антиген относится к типу «О».

Одновременно с главным опытом по определению типов вируса ящура ставят контроль ящурных компонентов, участвующих в реакции.

Учет результатов. Если испытуемая сыворотка содержит антитело, гомологичное антигену, используемому в реакции, образуется комплекс антиген + антитело, способный фиксировать на себе комплемент. В этом случае при добавлении компонентов гемолитической системы гемолиза не произойдет – реакция положительная. При отрицательной реакции комплемент остается в свободном состоянии и при добавлении эритроцитов, последние разрушаются – наступает гемолиз

Реакция нейтрализации вируса (РН) является одной из основных серологических реакций, широко используется для диагностики различных вирусных болезней, она наиболее специфична и высоко чувствительна, служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии.

Сущность РН заключается в том, что при вирусных болезнях в крови появляются вирусонейтрализующие антитела, которые при взаимодействии с вирусом (при смешивании вируса со специфической сывороткой), как в организме так и вне его (in vitro), способны обезвреживать его инфекционные свойства и способность вызывать заболевание у чувствительных лабораторных животных, куриных эмбрионов или вызывать цитопатогенные действия (ЦПД) в культурах ткани. Ставят РН на лабораторных животных, куриных эмбрионах или культурах ткани в зависимости от того, какая из этих живых моделей является чувствительной для данного вируса. Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, вирусы и их токсины. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры патогенность вирусов нейтрализуется и при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции.

Самостоятельная работа студентов.

1. Работая в парах, студенты готовят вируссодержащую взвесь из афт КРС.

2. Ставят главный опыт РСК: материал исследуют с сыворотками типа О, А и С для типизации вируса ящура.

3. Приготовливают разведения вируссодержащего материала, смешанные с нейтрализующими сыворотками.

Занятие 18. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) и метода ДНК-зондов в вирусологии

Цель занятия: развить у студентов знание молекулярно-биологических методов диагностики вирусных инфекционных заболеваний.

Оборудование и материалы: ПЦР - боксы с оборудованием, тест - системы для выявления ДНК- и РНК- содержащих вирусов методом ПЦР, материал и оборудование для проведения горизонтального электрофореза.

Теоретическая часть.

Преимущества полимеразной цепной реакции:

1. Позволяет выявлять вирусы независимо от фенотипической изменчивости.

2. Позволяет обнаруживать некультивируемые формы.

3. Высокая чувствительность: 10³ – 10⁴ КОЕ /мл.

4. Высокая специфичность: до 100 %.

5. Быстрота проведения анализа: 4 – 6 часов.

6. Возможность полной автоматизации.

7. Высокая информативность: позволяет выявлять единовременно нескольких возбудителей.

Принцип ПЦР.

ДНК – одна из самых длинных молекул, состоящая из двух цепей азотистых оснований, соединенных водородными связями по принципу комплементарности: А – Т, Г – Ц. Двухцепочечная ДНК при нагревании до 92 - 100°С подвергается денатурации с образованием двух отдельных цепей. При снижении температуры до комнатной происходит ренатурация – восстановление первичной структуры по принципу комплементарности.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

Компоненты реакционной смеси.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

1. Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжигом), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

2. Taq-полимераза - термостабильный фермент [выделенный из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.], обеспечивающий достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

ДНК-полимеразы - группа ферментов, которые синтезируют цепи полинуклеотидов из нуклеозидтрифосфатов. Они добавляют нуклеотиды к 3'-гидроксильной группе предыдущего нуклеотида в цепи ДНК, поэтому все полимеразы работают в направлении 5'--> 3'.

3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфа-та (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - "строительный материал", используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Концентрация дНТФ в реакционной смеси – 0,2 мМ.

4. Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфические продукты амплификации (ампликоны) не образуются.

5. Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Концентрация MgCl₂ в буфере должна быть 1,5 – 2 мМ. Увеличение концентрации приводит к снижению специфичности реакции, но к повышению чувствительности. Буфер содержит соли, бычий сывороточный альбумин, ПЭГ, глицерин.

6. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее вазелиновое масло. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:

1. Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95° С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2. Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название "отжиг".

Праймеры подбирают так, что они ограничивают (фланкируют) искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина - цитозин. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.

После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 '-конца праймера.

3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.

Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой:

Режим амплификации:

Для РНК-содержащих вирусов перед проведением амплификации, осуществляют обратную транскрибтацию с применением фермента ревертазы, для создания ДНК на матрице РНК. Полученную ДНК используют для постановки ПЦР.

Учет реакции проводится методом электрофореза фрагментов выделенной из материала и контрольной ДНК или по флуоресцентной метке, присутствующей на праймерах. В геле НК двигаются от минуса к плюсу и в зависимости от величины и структуры фрагмента, накапливаются в определенных участках агарозы. Сравнивается электрофоретическая подвижность образцов и положительного контроля.

Метод ДНК-зондов

Любой вирус включает одну специфичную для него молекулу (ДНК и РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов и обладают комплементарностыо. Чтобы обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту в материале от больного животного, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двухцепочечная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как-либо помеченной.

Комплементарность - это способность двух одинарных нуклеиновых кислот, связанных водородными связями в одну двухцепочечную, если, последовательность нуклеотидов одной точно соответствует последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары А - Т и Г - Ц (молекула ДНК) или А - У и Г - Ц (молекула РНК).

Принцип метода ДНК-зондов заключается в том, что для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в патологическом материале используют ДНК-зонды, т.е. меченные одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, которые комплементарны молекуле нуклеиновой кислоты специфичного (определенного) вируса и связываются с ней в двухцепочечную. Образовавшаяся двухцепочечная ДНК обнаруживается по включенному в нее зонду (метке).

Каждая молекула нуклеиновой кислоты - цепь нуклеотидов, каждый из которых состоит из азотистых оснований (Аденин, Гуанин, Цитозин, Тиамин или Урацил). Нуклеиновые кислоты различают двух видов: ДНК и РНК, различных по составу азотистых оснований и сахарами. У ДНК в нуклеотиде сахаром служит дезоксирибоза, и азотистые основания - А, Т, Г и Ц. У РНК - сахаром служит рибоза, а азотистые основания - А, У, Г, Ц. Соответствующие нуклеотиды могут связываться меж собой парами А - Т и Г и Ц.

Этапы метода ДНК-зондов