Схема диагностики вирусных инфекций

Диагноз на инфекционное заболевание ставится комплексно, учитывая эпизоотологические данные, клинические признаки, данные патологоанатомического вскрытия и лабораторные исследования, то есть из долабораторной и лабораторной диагностики.

Долабораторная диагностика проводится непосредственно в хозяйстве, включает в себя анализ наблюдений и исследований клинического состояния животного, эпизоотологических данных с привлечением результатов вскрытия (патологоанатомические изменения). Эпизоотологические данные включают сведения:

об охвате болезнью данного поголовья животных;

- о скорости и территориальном распространении болезни;

- о видах заболевших животных;

- о динамике выявления больных.

Клинические симптомы, то есть признаки болезни, включают:

- изменение температуры тела, пульса, дыхания;

- поведение животного, нарушение аппетита; состояние кожных покровов и слизистых оболочек;

- функционирование органов пищеварения, выделения и т.д

Результаты вскрытия. По результатам вскрытия устанавливают макроскопически наблюдаемые патологоанатомические изменения (в сравнении с нормой) формы, размера, цвета, консистенции, положения органов животного, наличие кровоизлияний, новообразований, узелков и т. д. На основании этих данных ставится лишь предварительный диагноз. Также можно определить характер болезни (инфекционный или не инфекционный). При этом ориентируются на то, что каждая инфекционная болезнь (вирусной или невирусной этиологии) характеризуется комплексом клинических симптомов, эпизоотическими особенностями и патологоанатомическими изменениями, но нередко симптомы эти наблюдают при нескольких заболеваниях. Необходимо также учитывать, что нередко болезнь бывает вызвана не одним, а двумя и более этиологическими факторами (например, вирусное заболевание осложняется бактериальной инфекцией). Но, несмотря на ориентировочный характер предварительного диагноза, совокупность всех его данных ориентирует ветеринарного специалиста на несколько болезней из многих возможных. В соответствии с предполагаемым диагнозом, отбирается патологический материал для лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика - окончательный диагноз на вирусную болезнь может быть поставлен только с учетом результатов лабораторных исследований, включающих методы экспресс-диагностики и вирусологического исследования.

Лабораторным исследованиям подвергают патологоанатомическйй материал от больных или павших животных. Задачи вирусологического исследования заключаются в обнаружении в нем вирусного агента и его идентификацию (установление видовой принадлежности). Обнаружение в патологическом материале следов пребывания вируса возможно экспресс-методами: электронной и световой микроскопией, генетическим методом (ПЦР, ДНК-зонд), обнаружение телец-включений, Для обнаружения антигена вируса в патологическом материале можно воспользоваться любой серологической реакцией (РИФ; РСК, РДП в агаровом геле, ИФА), используя гипериммунные сыворотки. Кроме того, обнаружение противовирусных антител в сыворотке крови животного с помощью специфического антигена также может свидетельствовать об обнаружении вируса в организме животного. Экспресс-методы позволяют быстро (в течение двух-трех дней), обнаружить антиген и установить его видовую принадлежность. Но, как правило, степень достоверности при экспресс-диагностике не очень велика и необходимо подтверждение диагноза другими методами (вирусологическими), включающими выделения и индикацию вируса на чувствительных лабораторных объектах с последующей идентификацией его в серологических реакциях.

Иногда в процессе обнаружения вируса уже создается определенное представление, с каким вирусом имеют дело: учитываются эпизоотологические (вид заболевшего животного, чувствительность лабораторной системы), клинические и патологоанатомические данные, способность вируса вызывать гемагглютинацию и гемадсорбцию.

Окончательно идентифицируют вирус в серологических реакциях. Этиологическая роль вируса считается доказанной, если в парных сыворотках крови животного будет установлено нарастание титра антител к выделенному вирусу (исследование парных сывороток крови животного с интервалом в две или три недели). Считают, что нарастание титров антител в четыре или больше раз во второй сыворотке по сравнению с первой свидетельствует об активном инфекционном процессе у животных в период исследования. Метод исследования парных сывороток крови является ретроспективным, однако тоже имеет важное значение для мероприятий по ликвидации вспышки вирусной инфекции.

Таким образом, обычно исследования патологического материала на вирусную инфекцию ведут одновременно по обоим направлениям: экспресс-методами и вирусологическими методами. Ответ получают вначале от экспресс-диагностики, а затем подтверждают его другими методами.

Самостоятельная работа студентов.

1. Используя учебное пособие для самостоятельной работы, лекционный материал и записи в тетрадях, по эпизоотическим данным, клиническим симптомам и патологоанатомическим признакам в заданиях, поставить предварительный диагноз на вирусную инфекцию.

2. Определить вид патматериала, составить сопроводительную в лабораторию.

3. Составить план лабораторных исследований полученного материала.

Занятие 22. Метод выделения рибонуклеопротеинов

Цель занятия: сформировать навык проведения анализа рибонуклеопротеинов дрожжей.

Оборудование и материалы: прессованные дрожжи, этиловый эфир, 3% раствор уксусной кислоты, 10% раствор серной кислоты, дифениламиновый реактив, 0,1н и 10% растворы гидроксида натрия, реактив Фелинга, молибденовый реактив, 1% раствор сульфата меди, водный раствор аммиака, 1% раствор нитрата серебра, центрифуга, водяная баня, термостат, вискозиметры, секундомер, пробирки, пипетки.

Теоретическая часть.

Выделение рибонуклеопротеина из дрожжей и анализ его компонентов

Дрожжи, являющиеся в данной работе источником рибонуклеипротеина, содержат большое количество свободных углеводов, фосфата и простых белков. Поэтому прежде чем изучить состав нуклеопротеинов дрожжей, нужно выделить из них очищенный нуклеопротеин.

Ход анализа.

В химическую пробирку помещают 8 г прессованных дрожжей и, проверив, что в лаборатории погашены все горелки и нет включенных электроплиток, добавляют 2-4 мл эфира для разрушения клеточных оболочек. Содержимое пробирки растирают стеклянной палочкой. Эфир разрушает оболочки дрожжевых клеток, после чего нуклеопротеины можно извлечь раствором гидроксида натрия.

В пробирку добавляют 5 мл 0,1н раствора гидроксида натрия и перемешивают содержимое стеклянной палочкой. Через 20 мин экстракт, содержащий нуклеопротеины, отделяют фильтрованием через бумажный фильтр в центрифужную пробирку с делениями. Если фильтрование идет медленно, в воронку добавляют несколько мл 0,1н раствора гидроксида натрия. Отфильтровав 3-4 мл экстракта, добавляют к нему двойной объем 3% уксусной кислоты. При этом нуклеопротеины выпадают в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, предварительно уравновесив пробирки.

После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок нуклеопротеинов промывают уксусной кислотой. Для этого в пробирку наливают 3% уксусную кислоту до метки 5 мл, осадок размешивают стеклянной палочкой и, уравновесив пробирки, отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают. Промывку повторяют еще 2-3 раза.

Гидролиз рибонуклеопротеинов. В широкую пробирку для гидролиза помещают осадок нуклеопротеинов и 4 мл 10% раствора серной кислоты. Пробирку закрывают пробкой, в которую вставлен обратный холодильник, и ставят на песчаную баню или асбестовую сетку газовой горелки.

Через 1 ч после начала кипения жидкости гидролиз прекращают, к остывшему гидролизату для нейтрализации прибавляют по каплям 10% раствор гидроксида натрия. Гидролизат фильтруют через бумажный фильтр. В фильтрате открывают продукты гидролиза нуклеопротеинов .

Реакции на компоненты нуклеопротеинов в гидролизате дрожжей.

1.Биуретовая реакция на полипептиды. К 5 каплям гидролизата дрожжей добавляют 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди (11). Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

2.Серебряная проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют 5 капель 1% раствора нитрата серебра. При стоянии через 3-5 мин выпадает небольшой рыхлый осадок серебряных соединений пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенных в бурый цвет.

3.Проба на рибозу и дезоксирибоу. К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель реактива Фелинга. Жидкость перемешивают и верхний слой ее нагревают до начала кипения. Выпадает красный осадок оксида меди (1) вследствие окисления рибозы и восстановления Cu(ОН)2 до Cu2О.

4. Обнаружение дезоксирибозы дифениламиновым реактивом. В пробирку вносят 5-10 капель гидролизата нуклеопротеинов, добавляют в два раза больший объем дифениламинового реактива, перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на 5-10 мин. Жидкость постепенно приобретает синее окрашивание, обусловленное реакцией дифениламина с дезоксирибозой.

5. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 20 каплям молибденового реактива (раствор молибдата аммония в азотной кислоте) добавляют 2-3 капли гидролизата и кипятят несколько минут на открытом огне. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорно-молибденового аммония.

Самостоятельная работа студентов:

1. Работая в парах, студенты выделяют рибонуклеопротеин из дрожжей.

2. Анализируют компоненты дрожжевого нуклеопротеина.

Занятие 23. Методика составления рецептур питательных сред для культивирования дрожжей, клеток растений и животных

Цель занятия: изучить состав сред для культивирования микрообъектов.

Оборудование и материалы: лабораторная посуда, автоклав, газовая горелка, весы, компоненты питательных сред, готовые сухие среды.

Теоретическая часть.

Составление сред для культивирования микроорганизмов

Сырье в биотехнологических производствах, особенно в крупнотоннажных, занимает первое место в статьях расхода и составляет 40-65% общей стоимости продукции.

Питательный субстрат или питательная среда является сложной трехфазной системой, содержащей жидкие, твердые и газообразные компоненты. Основной принцип составления рецептур питательных сред – удовлетворение физиологических потребностей микроорганизмов, а также поддержание оптимальных значений рН, температуры, кислорода и стерильности среды.

Приготовление обычных сред. К ним относятся среды, применяемые для выращивания большинства микроорганизмов – мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар и др

Приготовление мясной воды. Свежее говяжье или конское мясо освобождают от костей, сухожилий, жира и фасций, измельчают в мясорубке или нарезают ножом мелкими кусочками. Навеску измельченного мяса (50 г) заливают двумя объемами дистиллированной или водопроводной воды и оставляют для экстрагирования в холодильнике при температуре +4…+60С на 18-24 часа или помещают в термостат с температурой 370С на 2 часа. Настой кипятят до просветления (5-7 мин), охлаждают при комнатной температуре и фильтруют через ватный или бумажный фильтр. Фильтрат измеряют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой, разливают по флаконам, стерилизуют в автоклаве при температуре 1200С (1 атм.) в течение 30-40 мин и используют по назначению.

Правильно приготовленная мясная вода представляет слабокислую (рН 6,2), прозрачную, соломенно-желтоватую жидкость, не содержащую белков. В ней присутствует небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ.

Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ). К приготовленной мясной воде (100мл) прибавляют 1% пептона и 0,5% хлористого натрия, кипятят 1-2 мин при помешивании, затем охлаждают и определяют рН. Добавлени(панкреатин + вода) ем щелочи (1н раствора гидроксида натрия) или кислоты (1н раствор соляной кислоты) устанавливают рН среды 7,4-7,6. Для стабилизации рН рекомендуется к бульону добавлять фосфатные буферные смеси. Кипятят 30-45 мин для выпадения осадка, затем охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Проверяют и доводят рН до 7,4-7,6, разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют в автоклаве при 1200С (1 атм.) в течение 15-20 мин. Такой мясо-пептонный бульон пригоден для выращивания большинства бактерий. Из него легко приготовить ряд сред специального назначения.

Приготовление мясо-пептонного агара (МПА). К приготовленному мясо-пептонному бульону добавляют 2-3% мелко нарезанного, хорошо промытого агара. Смесь кипятят или прогревают в автоклаве до полного растворения агара. Охлаждают до 500С и для просветления добавляют белок куриного яйца, тщательно взбитого в двойном количестве холодной воды (белок одного яйца на 1 л среды). Среду прогревают в автоклаве при 0,5 атм. в течение 45 мин. Белок адсорбирует взвешенные в среде частицы, свертывается при высокой температуре и оседает хлопьями на дно.

Агар фильтруют через слой ваты или фильтровальной бумаги в горячем автоклаве или в специальной металлической воронке с подогревом. Проверяют и коррегируют рН. Разливают через стеклянную воронку с резинкой и зажимом в пробирки, флаконы, колбы и т.д., следя за тем, чтобы не смочить их края. Стерилизуют в автоклаве при температуре 1200С (1 атм.)в течение 15-20 мин. Пробирки с горячим жидким агаром извлекают из автоклава и раскладывают на столе в наклонном положении. Агар растекается по стенке пробирки и при застывании получается «скошенным». Для получения агара «столбиком» пробирки охлаждают в вертикальном положении.

Мясо-пептонный агар является основной плотной средой и служит для получения изолированных колоний микроорганизмов на питательной среде. Он употребляется в виде «простого» агара или после прибавления к нему питательных веществ и индикаторов в виде сложных дифференциально-диагностических или так называемых элективных сред.

Приготовление дифференциально-диагностических сред. Эти среды применяют для изучения биохимических свойств и для выделения чистых культур некоторых микроорганизмов. Они позволяют выявить выделяемые микробами энзимы, одни из которых расщепляют в различной степени белки и углеводы, а другие вызывают реакции окисления и восстановления. Сюда относятся жидкие среды с углеводами Гиса, плотные среды с индикаторами Эндо, Левина, Плоскирева и другие.

Среда Гисса. К 1% пептонной воде с рН 7,1 прибавляют 0,5-0,6% соответствующего углевода (глюкозы, сахарозы, лактозы, мальтозы и др.) и 0,5% индикатора Андреде (0,5 г кислого фуксина в 100 мл 1н раствора гидроксида натрия). Среды разливают по 4-5 мл в стерильные пробирки, на дно которых перед стерилизацией помещают узкий поплавок. Среды стерилизуют текучим паром 2-3 раза по 30 мин через каждые 24 часа или однократно паром под давлением 0,5 атм. 30 мин. Вместо жидких сред Гиса часто применяют полужидкие среды, содержащие 0,3-0,5% агар-агара и индикатор РВ. При сбраживании углеводов под действием ферментов среда изменяет цвет, а при образовании СО² в поплавке скапливается газ.

Среда Эндо. К 100 мл стерильного расплавленного мясо-пептонного агара добавляют 1г лактозы, растворенной и прокипяченной в 5мл дистиллированной воды, и 1 мл насыщенного спиртового основного фуксина, обесцвеченного перед добавлением к агару 10%-м водным раствором сульфата натрия до бледно-розового оттенка. Среду хорошо перемешивают, разливают в стерильные чашки и перед посевом подсушивают в термостате. Бактерии

E. coli, ферментирующие лактозу с образованием кислоты, формируют на этой среде красные колонии, а бактерии, не разлагающие лактозу, - бесцветные.

Составление сред для культивирования клеток растений и животных

Функции сред для выращивания клеток могут быть охарактеризованы следующим образом: 1 – поддержание необходимых для роста физико-химических условий (рН, осмолярность и др.); 2 – обеспечение клеток питательными веществами для синтеза клеточной биомассы и продуктов.

Для удобства среды могут быть подразделены на четыре группы:

1. Среды, необходимые для кратковременного выживания клеток;

2. Среды, необходимые для длительного выживания;

3. Среды, необходимые для обеспечения неограниченного роста клеток;

4. Среды, необходимые для осуществления специальных функций.

Кроме источников углерода, азота и других минеральных компонентов, среды для клеток многоклеточных организмов содержат специфические стимуляторы и регуляторы роста. Для клеток растений обычно необходимы индолилуксусная кислота, кинетин и гиббереллиновая кислота. Клетки животных нуждаются в ростовых веществах и незаменимых аминокислотах. Клетки растений и животных весьма чувствительны к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды. Известен общий состав сред для культивирования клеток растений и животных.

Среды для культивирования клеток могут создаваться на основе данных анализа плазмы крови и других биологических жидкостей (среда 199) или на основе уменьшения числа компонентов до минимума, необходимого для роста клеток (среда Игла).

Качество сред определяют рассчитывая два показателя:

1. Удельная скорость роста () популяции клеток:

 = 1/n . dn/dt ,

где n - число клеток /мл;

t - время.

Следовательно,  = ln2/ td, где td- время удвоения популяции.

2. Урожайность роста ( Y ), определяется частным:

Y = х / s

где х - увеличение биомассы (число клеток или их масса) в результате использования определенного количества s субстрата.

Например, урожайность клеток Hela равна 0,295, а клеток LS – 0,76 (в граммах сухого вещества биомассы на грамм использованной глюкозы).

Самостоятельная работа студентов:

1. Студенты на лабораторном занятии учатся составлять минимальную незаменимую среду (МЕМ) Игла.

2. Рассчитывают удельная скорость роста и урожайность роста.

3. Готовят среды из сухих фабричных порошков (на выбор).

Занятие 24. Методы отделения биомассы продуцента и разрушения клеток

Цель занятия: освоить метод выделения фибриногена из плазмы крови.

Оборудование и материалы: цитратная плазма крови, хлорид натрия, центрифуга, торзионные весы, стаканы, воронки, центрифужные пробирки, пипетки, стеклянная палочка, фильтры.

Теоретическая часть.

Выделение фибриногена из плазмы крови

Цитратную плазму крови получают путем прибавления к крови 3,8% раствора цитрата натрия

Для выделения фибриногена из плазмы крови точно отмеривают и наливают в центрифужную пробирку 2 мл плазмы крови. Отвешивают 20 мг сухого хлорида натрия, высыпают его в пробирку с плазмой и тщательно перемешивают до полного растворения. Наблюдают выпадение осадка.

Центрифужную пробирку с раствором уравновешивают с центрифужной пробиркой, в которую наливают дистиллированную воду. Пробирки помещают в центрифугу и центрифугируют 15 минут при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок представляет собой плотную массу с хорошо выраженной волокнистой структурой.

Осадок извлекают из пробирки и помещают на беззольный фильтр. Сжимая его, получают воздушно-сухой сгусток фибрина, который взвешивают на торзионных весах. Вес в норме составляет 9-12 мг на 1 мл цитратной плазмы. Для определения фибриногена в мг/дл полученную величину веса умножают на специально установленный коэффициент 22,2.

Самостоятельная работа студентов:

1. Студенты получают цитратную плазму крови.

2. Выделяют фибриноген из плазмы крови.

3. Определяют количество полученного фибриногена.

Занятие 25. Методы иммобилизации соединений

Цель занятия: сформировать навык проведения физической иммобилизации соединений.

Оборудование и материалы: 0,01% раствор фуксина, 0,1 раствор перманганата калия, ализарин, спирт этиловый, 96%; 0,1н и 1н растворы гидроксида натрия, 10% раствор хлорида бария, 10% раствор сульфата натрия, 15% раствор перекиси водорода, алюмокалиевые квасцы, 25% раствор аммиака, 15% серная кислота, 0,1н соляная кислота, колбы, мерные цилиндры, пробирки, пипетки, стеклянные палочки воронки, фильтры, сычужный фермент, молоко, силикагель, 1н раствор соляной кислоты, термостат, секундомер.

Теоретическая часть.

Иммобилизованные ферменты (ИФ) – это препараты, в которых молекулы ферментов связаны с матрицей или носителем. При этом каталитические свойства ферментов сохраняются полностью или частично. Способы иммобилизации ферментов могут быть физическими или химическими. Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ. К ним относятся: более высокая стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакционной среды и повторное использование, возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках. ИФ относительно стабильны к денатурирующим воздействиям – нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и т.д.

ИФ применяют в производстве L–аминокислот, 6-аминопенициллановой кислоты, из которой получают полусинтетические пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы, холестерина и др., для создания аппаратов “искусственная почка” и “искусственная печень”, для удаления эндотоксинов, образующихся в процессе заживления ран и ожогов, при лечении некоторых онкологических заболеваний и т.д.

Адсорбция

Адсорбция фуксина на стекле. В колбу наливают 50 мл раствора фуксина, оставляют на 10-15 мин, затем раствор сливают и колбу ополаскивают до тех пор, пока промывная вода станет совершенно бесцветной. Отмечают окрашивание стенок колбы фуксином.

В колбу наливают 15-20 мл этанола и встряхивают в течение 1 -2 мин. Спирт окрашивается в розово-красный цвет за счет перехода в него ранее адсорбированного на стенках колбы фуксина.

Адсорбция на осажденном сульфате бария. В цилиндр наливают 25 мл раствора перманганата калия, добавляют несколько мл раствора гидроксида натрия, 25 мл раствора сульфата натрия и 50 мл раствора хлорида бария. Цилиндр закрывают пробкой, тщательно перемешивают и оставляют на некоторое время для осаждения образовавшегося сульфата бария. После осаждения сульфата бария к надосадочной жидкости добавляют по каплям раствор перекиси водорода до обесцвечивания жидкости. Содержимое перемешивают. Надосадочная жидкость в цилиндре полностью обесцвечивается, а осадок сохраняет окраску адсорбированного на частичках сульфата бария перманганата калия, не вступивщего в реакцию с перекисью водорода. Иными словами, адсорбированное вещество настолько прочно связывается с адсорбентом, что не вступает в характерные для него реакции, даже если эти реакции протекают в системе, где находится адсорбент с адсорбирующимся веществом.

Адсорбция ализарина окисью алюминия. В мензурку наливают 25 мл квасцов и 5 мл аммиака. Содержимое мензурки доводят до 50 мл водой и размешивают стеклянной палочкой. Образуется студень гидроксида алюминия. В две пробирки наливают по 3-4 мл полученного студня. В одну из них добавляют 1-2 мл ализарина и кипятят, при этом студень окрашивается в розовый цвет адсорбированным на нем ализарином. Затем в обе пробирки добавляют по 3-4 мл серной кислоты. Студень гидроокиси алюминия во второй пробирке растворяется, тогда как студень с адсорбированным ализарином в кислой среде изменяет свою окраску из розовой на желтую, но не растворяется.

Следовательно, адсорбция - не только физический процесс, но также в какой-то мере и химическое явление, приводящее к образованию комплекса с новыми свойствами.

Материал исследования: 0,01% раствор фуксина, 0,1 раствор перманганата калия, ализарин.

Реактивы: спирт этиловый, 96%; 0,1н и 1н растворы гидроксида натрия, 10% раствор хлорида бария, 10% раствор сульфата натрия, 15% раствор перекиси водорода, алюмокалиевые квасцы, 25% раствор аммиака, 15% серная кислота, 0,1н соляная кислота.

Оборудование: колбы, мерные цилиндры, пробирки, пипетки, стеклянные палочки воронки, фильтры.

Иммобилизация сычужного фермента на силикагеле:

1. Активация силикагеля. Для активации силикагеля его тщательно промывают водой, а затем, каждый раз меняя раствор, 3-4 раза обрабатывают 1н раствором гидроксида натрия, вновь тщательно промывают водой и потом 3-4 раза 1н соляной кислотой. Полученный силикагель длительно отмывают водой. Готовый к употреблению силикагель должен находится под слоем воды.

2. Адсорбция сычужного фермента на силикагеле. В свежеприготовленный водный раствор фермента (0,5 г фермента растворяют в 100 мл воды) вносят силикагель в количестве 10 г. Взвесь перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 0С на 1 час, периодически перемешивают. За это время сычужный фермент адсорбируется на силикагеле. Извлеченный из термостата силикагель несколько раз промывают водой, высушивают на воздухе и хранят при температуре 4 0С в закупоренных флаконах.

3. Влияние ИФ на время свертывания молока. В три колбы наливают по 10 мл молока. В первую добавляют 1 г, во вторую 2 г силикагеля с иммобилизованным ферментом. Третья колба – контроль. По секундомеру замеряют время свертывания молока во всех трех колбах и делают выводы. После проведения опыта силикагель отмывают дистиллированной водой, высушивают и вновь используют для изучения скорости свертывания молока. В динамике регистрируют снижение активности иммобилизованного фермента.

Самостоятельная работа студентов:

1. Студенты осуществляют адсорбцию фуксина на стеклена стекле.

2. Студенты осуществляют иммобилизацию сычужного фермента на стеклена стекле.

Занятие 26. Метод получения нуклеината натрия из кормовых дрожжей

Цель занятия: изучить метод получения нуклеината натрия из кормовых дрожжей.

Оборудование и материалы: кормовые дрожжи, 10% раствор хлорида натрия, 1н соляная кислота, 1н гидроксид натрия, этанол, панкреатин (порошок), термостат, водяная баня, лед, фильтры, колбы, воронки, индикаторная бумага.

Теоретическая часть.

Получение нуклеината натрия

Нуклеинат натрия выделяется из кормовых дрожжей, которые содержат в среднем 7% РНК. Сначала проводят экстракцию РНК. Для этого отвешивают 50 г дрожжей, добавляют двойной объем 10% раствора хлористого натрия и помещают на кипящую водяную баню. Раствор РНК отделяют от дрожжевого шлама, охлаждают до 00С и подкисляют 1н соляной кислотой до рН 1-2.

Выпавшую в осадок техническую РНК растворяют в воде, доводя рН раствора добавлением 1н гидроксида натрия до рН 8-8,2, к раствору добавляют панкреатин (5% от общего объема раствора) и выдерживают около часа в термостате при температуре 37-400С.

Для инактивации фермента раствор кипятят 5-10 минут, после чего фильтруют. Для осаждения нуклеиновой кислоты к раствору добавляют охлажденный и подкисленный соляной кислотой до рН 1-2 этиловый спирт. Выпавший осадок фильтруют, промывают этанолом, растворяют в воде с добавлением гидроксида натрия до рН 6,2-6,5. Нуклеинат натрия осаждают спиртом, осадок фильтруют, промывают спиртом и сушат. Препарат имеет серо-желтоватый цвет, хорошо растворим в воде.

Самостоятельная работа студентов:

1. По методике студенты получают нуклеинат натрия из кормовых дрожжей.

Занятие 27. Методы анализа продуктов спиртового брожения

Цель занятия: изучить методы проведения качественных реакций на этиловый спирт.

Оборудование и материалы: дрожжи, 2% раствор глюкозы, 1% раствор виннокаменной кислоты, 10% раствор гидроксида натрия, концентрированная серная кислота, 30% уксусная кислота, 5% раствор йода в йодистом калии, ступка, пестик, аппарат для брожения, термостат, пробирки, пипетки, воронки, бумажные фильтры, стакан, индикаторная бумага, спирт этиловый, метанол, 1% раствор перманганата калия, концентрированная серная кислота, насыщенный раствор щавелевой кислоты, фуксинсернистый реактив, анилин, концентрированная соляная кислота, натронная известь, индикатор бромтимоловый синий, 0,05 н и 0,1 н растворы гидроксида натрия, 1% раствор салицилового альдегида, колбы с обратным холодильником, пробирки с притертыми пробками, пробирки для проведения химических реакций, пипетки, бюретки, колбы на 50 мл.

Теоретическая часть.

Спиртовое брожение лежит в основе получения этилового спирта, кормовых и пищевых дрожжей, пивоварения и виноделия. Возбудителями спиртового брожения могут быть дрожжи - сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы и бактерии. Среди названных организмов дрожжи занимают ведущее место, а получение с их помощью этанола относят к разряду наикрупнейших в мире.

В дрожжах содержится комплекс ферментов, под действием которого глюкоза, фруктоза и некоторые другие сахара превращаются в спирт и углекислый газ;

C6H12O6 ------> 2CO2 + 2CH3CH2OH

глюкоза этанол

Для получения этилового спирта из дрожжей, 3 г дрожжей растирают в фарфоровой ступке с 10 мл 2% раствора глюкозы. Содержимое ступки переносят в стакан с носиком, добавляют еще 60 мл раствора глюкозы и по каплям 1% раствор виннокаменной кислоты до кислой реакции (определяют по индикаторной бумаге).

Содержимое стакана переносят в прибор для брожения, причем заполнять прибор жидкостью нужно таким образом, чтобы запаянное колено трубки было заполнено, а в открытом колене имелось некоторое количество жидкости. Прибор ставят в термостат при 37°С, периодически наблюдают за образованием углекислого газа. Когда газ заполнит 1/4 - 1/2 закрытого колена, прибор вынимают из термостата и осторожно прибавляют в широкое колено 10% раствор гидроксида натрия почти до края. Отверстие закрывают большим пальцем, и прибор несколько раз переворачивают. Углекислый газ реагиует с гидроксидом натрия с образованием соды, что приводит к созданию вакуума.

Качественные реакции на этиловый спирт:

Образование этилового спирта в процессе брожения легко доказывается по появлению йодоформа, который образуется при реакции этилового спирта с раствором йода в йодистом калии в присутствии щелочи:

С2Н5ОН + 6NaOH + 4J2 -------> CHJ3 + HCOONa + 5NaJ + 5H2O

Для этого из прибора отфильтровывают в пробирку несколько мл жидкости, к ней добавляют 2-3 капли раствора йода и по каплям 10% раствор гидроксида натрия до обесцвечивания окраски йода. Появляется запах йодоформа.

Образование этилацетата: нагревают 2 мл фильтрата с равным объемом уксусной кислоты и серной кислоты. Ощущается запах этилацетата (характерный запах свежих яблок).

С2Н5ОН + СНзСООН —> СН3СООС2Н5 + H2O

Определение содержания примесей в этиловом спирте

В качестве примесей в этиловом спирте могут быть продукты его окисления (ацетальдегид и уксусная кислота), продукты дегидратации (непредельные соединения, обладающие восстановительной способностью), остатки продуктов сырья и полупродуктов синтеза. Например, если этиловый спирт был получен в результате брожения сахаристых веществ, в нем может быть примесь сивушных масел (смесь высших спиртов - бутилового и изоамилового), в гидролизном спирте, полученном из древесных опилок, может быть примесь метилового спирта, который очень ядовит. В качестве примеси в этиловом спирте могут быть дубильные вещества, если он хранился в дубовых бочках и т.д.

Определение содержания примесей альдегидов

Содержание альдегидов в этиловом спирте определяют колориметрическим методом путем сравнения окрасок растворов, полученных после реакции с фуксинсернистым реактивом.

В одну пробирку для колориметрирования из бесцветного прозрачного стекла вносят 10 мл 50% спирта, в другую - 10 мл стандартного раствора уксусного альдегида (50% этанол с известной концентрацией альдегида). В каждую пробирку добавляют по 2 мл фуксинсернистого реактива, пробирки закрывают пробками и взбалтывают. Через 20 мин сравнивают окраску растворов визуально, на белом фоне.

Образующаяся при реакции окраска, полученная с исследуемым спиртом, не должна быть интенсивнее окраски, полученной со стандартным раствором уксусного альдегида. Это свидетельствует о том, что альдегиды в спирте содержатся в норме.

Определение содержания сивушных масел

Сивушные масла представляют собой сложные многокомпонентные системы. Основными их компонентами являются изоамиловый и изобутиловый спирты. Поэтому при их анализе смесь этих спиртов используется в качестве типовых растворов.

В две колбы вместимостью 50 мл отмеривают: в одну 5 мл исследуемого спирта, в другую - 5 мл типового раствора (смесь спирта и известной концентрации примесей). В каждую колбу прибавляют по 0,2 мл 1% раствора салицилового альдегида и по 10 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое колб энергично перемешивают. Через 20 мин сравнивают окраски растворов, визуально на белом фоне. Спирт считается кондиционным, если его окраска слабее или одинаковая по интенсивности с окраской типового раствора, содержащего допустимое ГОСТом количество примесей.

Определение содержания метилового спирта

Анализ основан на реакции окисления метанола до формальдегида перманганатом калия в кислой среде.

В две пробирки отмеривают: в одну 0,1 мл испытуемого спирта, в другую - 0,1 мл типового раствора метанола. При испытании ректифицированного спирта первого сорта и высшей очистки применяют типовой раствор с содержанием 0,05% метанола по объему. В каждую пробирку прибавляют по 5 мл 1% раствора перманганата калия и 0,4 мл серной кислоты, разбавленной в 2 раза водой. Закрывают пробирки пробками и перемешивают. Через 2 мин в каждую пробирку прибавляют по 1 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты. Когда жидкость приобретет светло-желтую окраску, в пробирки приливают по 1 мл серной кислоты и после обесцвечивания раствора прибавляют по 5 мл фуксинсернистого реактива. Содержимое пробирок перемешивают. Через 35 мин сравнивают окраску испытуемого спирта и типовых растворов. Спирт считается выдержавшим пробу на метанол, если окраска его будет слабее или одинакова с окраской типовых растворов.

При малом содержании метанола в спирте указанное определение может быть недостаточно чувствительным, поэтому при анализе берут по 0,2 мл используемого спирта и типового раствора и дальнейшее определение ведут так же, как описано выше.

Повысить чувствительность метода можно увеличением продолжительности реакции до 60 мин. Важно, чтобы время реакции исследуемого спирта и типового раствора было строго одинаковым. Необходимо также точно соблюдать условия анализа.

Определение содержания фурфурола

Определение основано на способности фурфурола окрашивать гидрохлорид анилина в красный цвет.

В пробирку наливают 10 капель анилина и 3 капли концентрированной соляной кислоты. Добавляют 10 мл испытуемого спирта и перемешивают. Если в течение 10 мин раствор остается бесцветным, считается, что спирт выдержал испытание. Появление красного окрашивания указывает на наличие фурфурола.

Определение примесей кислот

Кислотность спирта обусловлена, главным образом, наличием свободной уксусной кислоты. Определение количества кислоты в спирте основано на титровании гидроксидом натрия с образованием соответствующих солей.

В коническую колбу на 500 мл с притертым шариковым холодильником помещают 100 мл испытуемого спирта, 100 мл дистиллированной воды и кипятят в течение 15 мин. После этого смесь охлаждают до комнатной температуры. Верхнюю часть холодильника закрыта трубкой с периодически обновляемой натронной известью. Колбу с жидкостью снимают с холодильника, добавляют в нее 10 капель раствора бромтимолового синего и титруют 0,05 н раствором гидроксида натрия до появления неисчезающей при взбалтывании в течение 1-2 мин голубой окраски.

Содержание кислот (Ск) в пересчете на уксусную (в мг/л) в безводном спирте вычисляют по уравнению:

Ск = 3 . 10 . 100 / Сс, где

3 - количество уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,05 н раствора гидроксида натрия, мг;

10 - коэффициент пересчета на 1 л спирта;

100 - коэффициент пересчета на безводный спирт;

Сс - крепость исследуемого спирта, % об.;

V -количество 0,05 н раствора гидроксида натрия, пошедшего на титрование 100 мл испытуемого спирта, мл.

Определение содержания примесей сложных эфиров

В спирте в качестве примесей содержится, главным образом, уксусноэтиловый эфир. Поэтому результаты анализов дают в пересчете на уксусноэтиловый эфир. Определение основано на их омылении гидроксидом натрия с образованием соответствующей соли уксусной кислоты и этилового спирта.

После определения содержания кислот к нейтрализованному спирту прибавляют 10 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры при закрытой верхней части холодильника трубкой с периодически обновляемой натронной известью, колбу отсоединяют. К содержимому колбы приливают 10 мл 0,1 н раствора серной кислоты. Избыток кислоты оттитровывают 0,05 н раствором гидроксида натрия.

Содержание эфиров (Сэф) в 1 л безводного спирта вычисляют в мг по формуле:

8,8 ×10 × 100

Сэф = [K(10 + V/2)-10] Сс , где

К- поправочный коэффициент на титр раствора гидроксида натрия;

10 - коэффициент пересчета на 1 л спирта;

V - количество 0,05 н раствора гидроксида натрия, пошедшего на титрование избытка кислоты, мл;

8,8 - количество уксусноэтилового эфира, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия,

100 - коэффициент пересчета на безводный спирт;

Сс- крепость исследуемого спирта, % об.

При установлении поправки коэффициента к титру 0,1 н раствора гидроксида натрия используют 0,1 н раствор серной кислоты. Для его определения в колбу вносят по 10 мл 0,1 н раствора серной кислоты и 0,1 н раствора гидроксида натрия. Избыток кислоты оттитровывают 0,05н раствором гидроксида натрия.

Поправочный коэффициент (К) к 0,1н раствору гидроксида натрия вычисляют по формуле:

К = 10 + v/2 , где

10 - количество 0,1 н раствора гидроксида натрия и серной кислоты, мл;

v/2 - количество 0,05 н раствора гидроксида натрия, пошедшего на титрование избытка кислоты, мл. Раствор гидроксида натрия следует готовить с поправочным коэффициентом 0,97 – 0,99.

Самостоятельная работа студентов:

1. Студенты получают этиловый спирт из дрожжей.

2. Определяют его присутствие.

3. Определяют качество спирта по наличию примесей.

Тема 28. Метод получения нативной сыворотки

Цельзанятия: изучить технологию производства сыворотки крови.

Оборудование и материалы: спирт 70°, вата, иглы кровобрательные, лабораторная посуда, термостат, 0,5% хлороформ.

Теоретическая часть.

Технология получения нативной сыворотки

1. Сбор крови. Кровь собирают полой иглой или ножом с соблюдением асептики в стерильную посуду. Изъятие крови производят прижизненно или во время убоя. Кровь дефибринируют.

2. Получение сыворотки. Собранную дефибринированную кровь сепарируют с соблюдением асептики.

3. Консервирование сыворотки. Отделенную от форменных элементов и фибрина сыворотку консервируют хлороформом (0,5%).

4. Обработка сыворотки. Законсервированную сыворотку выдерживают в реакторе 5-10 ч при температуре 0-1°С для отделения от остатков фибрина. Сыворотку стерилизуют путем фильтрации через стерилизующие фильтры.

5. Розлив готового препарата. Отфильтрованную стерильную сыворотку разливают в стерильные флаконы по 250 и 500 мл. По внешнему виду нормальная сыворотка представляет собой жидкость желтовато-соломенного цвета со следующими физико-химическими показателями: pH 7,1-8,3, содержание белка 5,0-7,2% , количество золы – 0,2 – 0,5%.

При температуре 4-10°С продолжительность хранения такой сыворотки практически не ограничено. Нативную сыворотку крупного рогатого скота или лошадей используют для приготовления питательных сред для бактериологических целей.

Самостоятельная работа студентов:

1. Студенты берут кровь у МРС.

2. Получают сыворотку из крови.

3. Консервируют сыворотку.