Методика определения титра вируса в БОЕ

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки (островки мертвых, не окрашенных клеток в слое окрашенных живых) в зараженных культурах клеток, залитых агаровой средой с красителем нейтральрот и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами.

Количество вируса при этом может быть измерено, соответственно, в бляшкообразуюших единицах (БОЕ) и оспообразующих единицах (ООЕ): 1 БОЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной бляшки; 1 ООЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной оспины. Методика определения титра вируса в БОЕ (ООЕ) заключается в следующем:

1. Точно отмеренными и строго одинаковыми объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов на ХАО.

2. Подсчитывают количество образовавшихся в каждом матрасе бляшек или в каждом курином эмбрионе оспин.

3. Рассчитывают среднее арифметическое этого количества, которое равно количеству БОЕ или ООЕ вируса в заражающей дозе вируссодержащего материала.

4. Титр вируса (Т) рассчитывают по формуле:

Т = среднее арифметическое количество бляшек (оспин) / объем заражающей дозы х разведение вируссодержащего материала.

Считается, что счету поддаются бляшки и оспины, если их количество не превышает 50 на матрас или ХАО. Иногда, в случае высокой концентрации вируса в материале, бляшки в культуре клеток или оспины на ХАО могут сливаться, и их невозможно будет сосчитать. В таких случаях готовят несколько десятикратных разведений испытуемого материала и каждым разведением в одинаковых дозах заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов, затем рассчитывают среднее арифметическое количество бляшек или оспин для каждого разведения. Титр вируса в этом случае рассчитывается по более сложной формуле:

Т = сумма средних арифметических количества бляшек (оспин) в каждом разведении / объем заражающей дозы х сумму разведений вируссодержащего материала

Метод титрования вирусов в БОЕ дает наиболее достоверные данные о концентрации вирусов, но он встречает технические трудности с подсчетом бляшек. Что касается оспин, то их использование ограничивается довольно немногочисленными вирусами, способными образовывать узелки на ХАО куриных эмбрионов.

Метод образования бляшек основан на образовании вирусом в однослойных культурах, залитых агаровой средой, содержащей витальный краситель - нейтральрот, негативных колоний или бляшек. Бляшки представляют собой обесцвеченные участки культуры, состоящие из погибших под действием вируса клеток. Некоторые вирусы дают бляшки без покрытия слоем агара: вирус чумы крупного рогатого скота, осповакцины, некоторые вирусы герпеса.

При постановке бляшек лучше использовать культуры, выращенные во флаконах или матрасах, культура должна быть без признаков дегенерации. На клетки, промытые раствором Хенкса, наносят вирус в определенных разведениях и обеспечивают контакт вируса с клетками, периодически покачивая в течение 1-2 часов при температуре 37-38°С. Неадсорбировавшийся вирус удаляют путем промывания раствором Хенкса или отсасывают пастеровской пипеткой, а на слой клеток наносят специальное агаровое покрытие, содержащее раствор Эрла, краситель, бычью сыворотку, антибиотики и другие компоненты. Выбор среды покрытия определяется видом клеток и вируса. После застывания с поверхности агара сливают конденсированную влагу, флаконы переносят в термостат и инкубируют клетками вверх при оптимальной для конкретного вируса температуре. За это время вирусы начинают поражать клетки. При этом раствор красителя окрашивает только живые клетки. Поэтому на сплошном красновато-розовом фоне слоя живых клеток появляются бесцветные пятна (бляшки) - пораженные вирусом клетки. Если вирус высокой концентрации, бляшки быстро сливаются. Время появления и морфология бляшек зависят от вида и штамма вируса, типа клеток и условий культивирования.