ВВЕДЕНИЕ 2 страница. Препараты для метода флуорохромирования можно готовить двумя способами:

Препараты для метода флуорохромирования можно готовить двумя способами:

а) на свежий мазок-отпечаток (из органов, соскобов со слизистых оболочек или суспензии инфицированных клеток) наносят 1-2 капли рабочего раствора (1:10 000) акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом. Приготовленный таким образом свежий (в течение 10-20 мин после его приготовления) препарат рассматривают в люминесцентном микроскопе;

б) мазки отпечатки, полученные из патологического материала, или инфицированные культуры клеток (на покровных стеклах) фиксируют 96° этиловым спиртом в течение 15-30 мин, промывают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридинового оранжевого (1:10 000), через 5-10 мин накрывают покровным стеклом и исследуют.

В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах клеток, дает изумрудно зеленое свечение, РНК, находящаяся в цитоплазме, светится красным или оранжевым цветом. В препаратах ДНК содержащих вирусов, например, аденовируса, вирусный материал светится зеленым цветом в ядре в виде гранул различной величины. При наличии в препарате РНК, содержащего вирус, например, вируса гриппа, вирусный материал обнаруживается в виде ярко красных гранул в цитоплазме клеток.

Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное), применяют обработку препаратов 0,5 % раствором РНК-азы или ДНК-азы в течение 5-10 мин или облучение УФ лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные продолжают светиться еще 20-30 мин, что служит доказательством специфичности вирусных нуклеиновых кислот. Метод простого флуорохромирования несложен, однако в большинстве случаев он не дает возможности полно дифференцировать возбудителей болезни.

МФА - метод флуоресцирующих антител (реакция иммунофлуоресценцин РИФ). Принцип данного метода заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома. Таким образом, с помощью МФА реализуется непосредственный контроль за первой фазой серологических реакций, причем специфичность метода сочетается с высокой чувствительностью.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные противовирусные сыворотки, максимально освобожденные от гетероантител. Из таких сывороток выделяют гомогенные фракции, содержащие антитела, которые метят флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ - флуоресцеина изотиоционат (зеленое свечение) и PCX - родамина сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.

Хранить конъюгаты рекомендуется при температуре минус 20°С или при более низких температурах в герметически закрытых сосудах. Можно также консервировать конъюгат путем добавления тиомерсала 1:10000 и хранить при температуре 4°С. Флуоресцирующие сыворотки или их глобулиновые фракции длительное время сохраняют специфическую активность в лиофилизированном состоянии.

Для исследования иммунофлуоресцентным методом используют мазки, отпечатки (отпечаток должен быть тонким и равномерным), гистологические срезы и культуры клеток. Мазки готовят из смывов, органов и тканей, в которых предполагается наибольшая концентрация вируса. Для выявления вируса гриппа или других возбудителей респираторных болезней очищают носовой ход от слизи и берут смыв со слизистой оболочки ватным тампоном, который помешают в пробирку с забуференным физиологическим раствором или питательной средой для культур клеток (3 мл). Тампон встряхивают, отжимают и удаляют, раствор центрифугируют из осадка, делают мазки. Исследование слизистых оболочек, выстланных многослойным плоским эпителием (например, глотки, конъюнктивы, влагалища), требует приготовления соскобов после очистки слизистой оболочки. Поверхностные ороговевшие клетки таких эпителиев обладают сильной аутофлуоресценцией и не годятся для исследования. Поэтому препараты готовят из клеток скарифицированных участков, содержащих базальные слои эпителия. Препараты из культуры клеток (в случае, если вирусы предварительно накапливают в культурах клеток) выращивают на узких пластинках покровного или такого же размера обрезках предметного стекла. Извлеченные в разные сроки после заражения из пробирок с культурой клеток эти пластинки осторожно отмывают от питательной среды физиологическим раствором или фосфатным буфером. Затем сушат при комнатной температуре на воздухе на чистом листе фильтровальной бумаги, положив клеточным слоем вверх, и фиксируют.

Предметные стекла, применяемые для приготовления препаратов, должны быть тонкими, чистыми, обезжиренными, бесцветными и не иметь царапин. Для этого их промывают в нейтральных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром. Перед употреблением чистые стекла проводят через пламя горелки и охлаждают. Все надписи делают простым карандашом на специально подготовленной матовой площадке у края предметного стекла (восковой карандаш при фиксации препаратов растворяется и образует на стекле восковую пленку, мешающую обработке мазков флуоресцирующими сыворотками).

Наилучший фиксатор для вирусных антигенов - чистый ацетон, охлажденный до минус 10-15°С; можно также использовать метиловый спирт. Фиксируют препараты 10-20 мин. Продолжительность и температура фиксации могут колебаться в зависимости от вида вируса. При особо опасных инфекциях время фиксации увеличивают. Например, при работе с уличным вирусом бешенства препараты фиксируют не менее 4 ч.

С целью уменьшения неспецифической фоновой флуоресценции исследуемых препаратов применяют так называемое контрастирование неспецифического свечения. Для этого непосредственно перед обработкой препаратов в специфическую флуоресцирующую сыворотку добавляют альбумин нормальной сыворотки лошади или быка, окрашенный родамином (излучающим красный цвет). В таком препарате специфический антиген будет светиться зеленым, а фон препарата (свободные от вируса клетки и т.п.), адсорбируя альбумин, окрашивается в оранжево-красный или бурый цвет (контрольный по отношению к зеленому). Различают два основных способа применения МФА; прямой и непрямой.

Прямой или одноступенчатый метод заключается в том, что на приготовленный препарат наносят конъюгат и выдерживают в течение 20-60 мин при температуре 37°С во влажной камере (или более длительное время при 4°С), Затем препараты отмывают физиологическим раствором (рН 7,2-7,5) от несвязанного с антигеном конъюгата. Затем их подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Результаты учитывают по интенсивности и специфичности флуоресценции исследуемого объекта с учетом структурных особенностей по следующей шкале:

(++++) - яркая, сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета;

(+++) - яркая флуоресценция зеленого цвета;

(++) - слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета;

(+) - очень слабая флуоресценция неопределенного цвета;

(-) - объект не флуоресцирует.

В качестве обязательного контроля берут препараты из материалов, не содержащих искомый вирус (нормальные тканевые культуры, отпечатки органов здоровых животных). Их обрабатывают так же, как опытные препараты, и одновременно с ними. Прямой метод позволяет выявить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку. МФА особенно широко используется в вирусологии для диагностики большинства вирусных болезней животных. Благодаря специфичности, высокой чувствительности, доступности, быстроте и относительной простоте, МФА используется с целью индикации и идентификации вирусных антигенов (особенно для вирусов, не обладающих цитопатогенными, гемагглютинирующими и гемадсори-рующими свойствами); выявления и титрования противовирусных антител, а также аутоантител. МФА делает возможным морфологическое изучение процессов взаимодействия вирусов с клетками, динамики накопления вирусных антигенов в клетке, антигенных связей вирусов, а также патогенеза вирусных инфекций. Особенно большое значение этот метод имеет при изучении смешанных и хронических инфекций.

МФА относится к экспресс-методам диагностики, так как в течение короткого времени (нескольких часов) он позволяет обнаруживать вирусные антигены даже при наличии их малых доз.

Непрямой метод предполагает предварительную обработку препарата нефлуоресцирующей специфической сывороткой. А затем, после промывки, препарат обрабатывают антивидовой люминесцирующей сывороткой. Это позволяет значительно снизить затраты на проведения анализа, так как флуоресцирующие сыворотки не предназначены для длительного хранения и их стоимость на много выше, чем у нелюминесцирующих.

Самостоятельная работа студентов:

1. Ознакомление с устройством люминесцентного микроскопа.

2. Студенты зарисовывают схему прямого и непрямого метода РИФ.

3. Работая в парах, студенты готовят препараты для просмотра в люминесцентном микроскопе.

4. Один мазок флюорохромируют, другие окрашивают прямым и непрямым методом и микроскопируют.

Занятие 7-8. Использование лабораторных животных в диагностических вирусологических исследованиях

Цель занятия: изучить цели и способы применения лабораторных животных для вирусологических исследований. Ознакомить студентов с методами заражения лабораторных животных (белых мышей).

Оборудование и материалы: набор инструментов в стерилизаторе (ножницы, иглы, шприцы, пинцеты), белые мыши, ватные спиртовые тампоны, краски для мечения мышей, вируссодержащий материал, эфир, ксилол.

Теоретическая часть:

В настоящее время вирусологические исследования выполняются на 250 видах животных. К ним предъявляют определенные требования по возрасту, полу, весу, физиологическому состоянию и восприимчивости. Широко используют мини – животных, гнотобионтов (СПФ- животные, безмикробные, моно-, ди- и поликонтаминированные животные). Наиболее часто в качестве подопытных животных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, хомяков и хорьков, реже применяют голубей, кур и в ряде случаев используют для биопробы собак, поросят, телят, овец и др. животных. Выбор лабораторных или других животных и способов заражения зависят от вида вируса, который предполагается выделить. В случаях, когда невозможно установить вид предполагаемого вируса, заражают несколько видов животных. Если лабораторные животные нечувствительны к данному вирусу (чума свиней, инфекционная анемия лошадей и др.) заражают основного хозяина.

Для проведения биопробы животных берут здоровых, приобретенных из заведомо благополучного хозяйства или питомника, восприимчивых к изучаемому заболеванию. Большое значение имеет возраст, т. к. к вирусам наиболее чувствительны молодые животные, а в некоторых случаях используют даже сосунов. Животные должны получать полноценный рацион и содержаться в надлежащих санитарных условиях, имеет значение в некоторых случаях и пол. Приобретенных животных перед использованием их для заражения обязательно выдерживают в карантине, а перед опытом тщательно осматривают и иногда измеряют температуру тела (нормальная температура тела у белых мышек 37.0-39.0°С, у кроликов 38.7°-39.5°С, у морских свинок и белых крыс 38.5°-39.5°С, у кур и голубей 41.5°-41.8°С, у собак и кошек 38.0°-38.5°С). Содержат лабораторных животных в специальных клетках и в отдельном помещении. После заражения животных маркируют (метят) и содержат отдельно от здоровых. Одним и тем же материалом в каждом опыте обычно заражают несколько животных с тем, чтобы исключить возможную индивидуальную резистентность подопытных животных.

Вирусы обладают тропизмом к определенным тканям в организме. Этим и определяется выбор способа введения. Так, например, для выделения нейротропных вирусов заражение проводят в мозг, при выделении респираторных - интраназально, дерматропных - на кожу или внутрикожно и т. д. Поскольку при первичном заражении животных они могут не заболеть, то через 6-8 дней здоровых на вид зараженных животных убивают, а их органы используют затем для заражения следующей партии животных, делают обычно три бессимптомных (слепых) пассажа. Результаты выделения вируса считают положительными в тех случаях, когда у животных после соответствующего инкубационного периода развиваются клинические признаки болезни и когда это заболевание удается передавать от одного животного к другому при пассажировании.

При заражении подопытных животных нужно обеспечить соответствующую их фиксацию. Это достигается при помощи специальных приспособлений (доски, стенки и т. д.) или же животное держит помощник. Кролика помощник берет правой рукой за кожу спины, поднимает и закладывает его задние лапы под мышку левой руки. В таком положении кролик оказывается крепко зафиксированным. Можно фиксировать кролика и другим способом: сидя на стуле, взять его задние лапы, поднять, а голову и передние лапы зажать между ногами. Для фиксации морских свинок в одной руке зажимают задние лапы, а в другой - передние и голову. Мышей для фиксации одной рукой берут за хвост, а другой захватывают за кожу в области верхней части шеи, поднимают и в таком положении держат в момент заражения. При работе с мышами можно обходиться и без помощников, используя пинцеты Пиана.

Место введения материала тщательно обрабатывают: шерсть выстригают, кожу протирают спиртом и смазывают йодом.

В лабораторных исследованиях наиболее часто пользуются следующими методами (способами) введения вируссодержащего материала:

а) подкожный метод - материал вводят под кожу в области спины, области бедра, мышкам в области поясницы у корня хвоста. Кожу на месте введения оттягивают пальцами и вводят материал;

б) внутримышечный метод - материал вводят в толщу мышц в области бедра или груди (у птиц);

в) внутрикожное заражение - материал тонкой и острой иглой вводят в толщу кожи и на месте введения образуется бугорок;

г) внутрибрюшинный метод - животное фиксируют в вертикальной положении вниз головой и материал вводят в области паха (лучше, если животное перед заражением было долго некормленным);

д) внутривенное заражение (интравенозный метод) - материал вводят тонкой иглой мышам и крысам в хвостовую вену, кроликам - в краевую вену уха, морским свинкам в сердце. Материал не должен содержать крупных частиц и пузырьков воздуха. Чтобы лучше вырисовывалась вена, рекомендуется протирать ксилолом или бензолом;

е) заражение животных в нос (интранозальный метод) - для введения материала лабораторных животных предварительно наркотизируют в банке с эфиром и в результате наступает глубокий сон, но не продолжительный. Материал вводят в обе ноздри по 2-3 капли;

ж) заражение в мозг (интрацеребральный метод) - материал вводят в мозг головной в толщу или под твердую мозговую оболочку. У крупных животных делают предварительно трепанацию черепа, мышкам вводят иглой выше и левее или правее точки пересечения линий: средней сагитальной и линии, соединяющей верхние углы орбиты глаз. Доза для мышей 0,02-0,03 мл, для кроликов 0,3-0,5 мл;

з) заражения в переднюю камеру глаза - материал вводят тонкой иглой, после предварительного обезболивания глаза кокаином, через роговицу на границе с белочной оболочкой и после того как стечет несколько капель жидкости из передней камеры глаза. Вводят материал в дозе 0,05-0,1 мл в один глаз, другой остается в качестве контроля;

и) заражение в кончик носа (в верхнюю губу) мышек - при бешенстве.

Кроме перечисленных методов, в ряде случаев экспериментальным животным скармливают зараженные корма (алиментарный метод), наносят инфицированный материал на кожу, на конъюнктиву или роговицу глаза, заражают субокципитально в спинномозговую жидкость и т.д.

Гибель зараженных животных в первые сутки возможна от травмы. Срок наблюдения за зараженными животными устанавливают из расчета в 2-3 раза превышающий максимальную длительность инкубационного периода при этом заболевании. В это время, при необходимости, можно выполнять серологические прижизненные обследования их.

Животных, павших при экспериментальном заражении, немедленно вскрывают, проводят патологоанатомическое исследование и собирают материал для других вирусологических исследований или для перезаражения. Вскрытие проводят стерильными инструментами со строгим соблюдением асептики и личной профилактики. Для исключения бактериальной инфекции проводят посевы материала на питательные среды для аэробов и анаэробов. Трупы после вскрытия и взятия материала утилизируют сжиганием в печах или автоклавированием.

Кроме выделения вирусов лабораторные животные широко применяются и для других целей: изучение патогенеза и патоморфологии при вирусных инфекциях, для титрования вирусов, для получения живых ослабленных противовирусных вакцин и гипериммунных сывороток, для аттенуации (ослабления вирулентности) вирусов, для сохранения и поддержания вирусов в условиях лаборатории и т. д.

Вскрытие лабораторных животных проводят сразу же после их гибели. Если не погибло зараженное животное, то его убивают, когда максимально проявляются симптомы болезни или при отсутствии их на 8-10-й день после заражения. Убить животное можно избыточной дозой наркоза, декапитацией (отрезанием головы), мелких животных - путем разрыва спинного мозга, растягивая за голову и хвост быстрым коротким движением. Трупы мелких животных в спинном положении фиксируют на кювете, залитой парафином с помощью инъекционных игл, более крупных - на специальных вскрывочных столах. Используют стерильные инструменты, а шерсть животного по линии разреза обрабатывают дезинфицирующим раствором.

Разрез кожи делают по белой линии от лонной кости до шеи, приподнимая пинцетом кожу. После чего кожу разрезают по направлению к каждой их четырех конечностей, отпрепаровывают и фиксируют иглами в парафине.

Вначале вскрывают брюшную полость от разреза под линией диафрагмы до лонной кости, заменив инструменты. В качестве вируссодержащего материала из брюшной полости берут кусочки печени, селезенки, почки, брыжеечные лимфоузлы, участок кишечника при наличии патологоанатомических изменений.

Грудную полость вскрывают путем удаления ребер вместе с грудной костью. Череп вскрывают, укрепив животное в брюшном положении, обрабатывают кожу головы дезраствором. Разрез кожи делают перпендикулярно оси тела за ушами, продолжают слева и справа вперед к глазницам. Кожу вместе с ушами отпрепаровывают и отбрасывают вперед, оголяя черепную коробку. Браншу ножниц вставляют в большое черепное отверстие и режут кости черепа влево и вправо по направлению к глазницам. Затем разрезают кости черепа между глазницами и удаляют весь вырезанный участок. Толстые кости черепа распиливают. Мозг извлекают из основания черепа, подрезав черепно-мозговые нервы.

При вскрытии в качестве вируссодержащего материала отбирают органы, имеющие патологоанатомические изменения, и регионарные пораженному органу лимфоузлы. Каждую пробу материала размещают в двух стерильных пробирках под резиновыми пробками. Содержимое одной пробирки, предназначенное для вирусологических исследований, заливают соответствующим фиксирующим раствором. Если предполагаются микроскопические методы обнаружения вируса (световая, люминесцентная микроскопия), из патологического материала делают мазки и мазки-отпечатки.

Для приготовления отпечатков орган или головной мозг выкладывают на фильтровальную бумагу и прочно фиксируют. По вертикальной плоскости, не нарушая структуры органа, отрезают небольшой кусочек, выкладывают его срезом вверх и прикладывают сверху обезжиренное предметное стекло. Полученные отпечатки высушивают на воздухе.

Самостоятельная работа студентов.

1. Студенты работают по 2 человека на подготовленных рабочих местах: заражают белых мышей: внутривенно (в боковую вену хвоста), внутримышечно, подкожно, интраназально, внутрибрюшинно.

2. Проводят мечение зараженных лабораторных животных.

3. Работая в парах, студенты вскрывают зараженных лабораторных животных. При этом, непогибших умерщвляют смещением шейных позвонков.

Занятие 9-10. Культивирование вирусов на куриных эмбрионах

Цель занятия: определить цели и способы применения куриных эмбрионов в вирусологии, ознакомить студентов с методами заражения и вскрытия куриных эмбрионов для культивирования вирусов.

Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневные (КЭ), овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пастырь, иглы, шприцы, простой карандаш, пробойники, иголочки.

Теоретическая часть.

Преимущества куриных эмбрионов перед лабораторными животными:

- эмбрион защищен от бактериального заражения со стороны внешней среды скорлупой и подскорлупной оболочкой;

- высокая чувствительность к широкому спектру вирусов, т. к. у эмбрионов не развита система защитных механизмов;

- легкодоступность в связи с развитием широкой сети птицефабрик; - экономичность (не требуют ухода и кормления).

К недостаткам следует отнести отсутствие гарантии стерильности куриных эмбрионов. Присутствие патогенных агентов и вирусов в них могут искажать результаты исследований.

Требования к куриным эмбрионам, используемым в вирусологических исследованиях, следующие:

- возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения;

- скорлупа яиц должна быть чистой (мыть нельзя), непигментированной;

- хозяйство, из которого получены эмбрионы, должно быть благополучным по инфекционным болезням;

- эмбрионы не должны охлаждаться при доставке их из инкубатория. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37°С и влажности 60-70 %, размещая их в специальных штативах камерой вверх.

Подготовка эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы. Овоскопирование - это просмотр яиц против достаточно яркого источника света, лучше в затемненном помещении, в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур. Для этого используют овоскоп. Определяют, жив зародыш или погиб. Живой зародыш, как правило, активно двигается, сосуды на ХАО достаточно кровенаполнены.

На скорлупе карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5x0,5 см. Эти отметки являются ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала.

Заражение проводят в асептических условиях, лучше в боксе. Для этого в предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем повторно протирают в боксе. Можно для этих целей использовать и фламбирование - обработку пламенем смоченного спиртом тампона. В работе также используют стерильные инструменты. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем горелки перед каждым повторным использованием. Эмбрионы фиксируют на подставке, которую устанавливают в кювете на смоченной дезинфицирующим раствором марлевой салфетке.

Методика заражения куриных эмбрионов

Выбор метода определяется тропизмом вируса и целью заражения. Разработано шесть методов заражения эмбрионов. Заражение в аллантоисную полость и на ХАО используют более часто. Реже заражают в амниотическую полость и в желточный мешок, и совсем редко - в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Объем инфекционного материала для заражения при любом методе составляет 0,1-0,2 мл.

Заражение в аллантоисную полость

При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Существует несколько вариантов этого метода. Первый вариант: эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша на 5-6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.

Второй вариант: эмбрион фиксируют в горизонтальном положении и делают в центре над воздушной камерой отверстие для выхода воздуха. Отверстие же для самого заражения делают на участке бессосудистой зоны хорионаллантоисной оболочки (ХАО) со стороны зародыша. Иглу вводят на глубину не более 2-3 мм, после инъекции закрывают отверстие парафином.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку

Часто этот метод используют для культивирования эпителиотропных и пантропных вирусов оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных, болезни Ауески. Такое заражение также выполняют в разных вариантах. В первом варианте для заражения через естественную воздушную камеру эмбрион помещают вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают круглое окно диаметром 15-20 мм. Через него пинцетом снимают подскорлупную оболочку и на обнажившийся участок ХАО наносят вируссодержащий материал. Отверстие закрывают лейкопластырем или покровным стеклом с использованием расплавленного парафина. Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, поскольку обеспечивается контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО, и поэтому больше накапливается вируса. При этом эмбрион фиксируют горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры - для отсасывания воздуха, а другое - сбоку со стороны зародыша, диаметром 0,2-0,5 см. Сложность этого варианта заражения в том, что делать второе отверстие нужно осторожно - снять кусочек скорлупы и, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры. В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО. На поверхность ХАО и наносят вируссодержащую жидкость, а отверстие закрывают лейкопластырем. Первое отверстие над воздушной камерой не закрывают, так как внутренний листок подскорлупной оболочки не нарушен и играет роль защитного барьера. Инкубацию эмбрионов проводят в горизонтальном положении.

Заражение в желточный мешок

Этот метод используют для культивирования хламидий, вируса болезни Марека, ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец. Также существует несколько вариантов. В первом варианте эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. Делают отверстие над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4,0 см под углом 45°С в направлении, противоположном от зародыша.

Второй вариант заключается в том, что эмбрион фиксируют горизонтально, при этом зародыш находится внизу, а желток - над ним. Через отверстие в скорлупе в желток, который находится вверху, вводят инфицированный материал.

Заражение в амниотическую полость

Заражение в амниотическую полость проводят закрытым и открытым способом. Таким образом, культивируют вирус гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей. Закрытый способ: заражение проводят в затемненном боксе, фиксируя эмбрион на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. При правильном введении тело зародыша двигается в направлении передвижения иглы.

Открытый способ: эмбрион фиксируют горизонтально и срезают скорлупу над воздушной камерой размером 1,5-2,5 см в диаметре. Пинцетом снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомическим пинцетом (14 см) с сомкнутыми браншами продавливают ХАО по направлению к зародышу и захватывают амниотическую оболочку, подтягивая ее к отверстию. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной оболочкой амниона вводят вируссодержащий материал. После инъекции все оболочки опускают, отверстие закрывают лейкопластырем.

Заражение в тело зародыша

Заражение в тело зародыша проводят также, как в амнион, закрытым и открытым способом. Разница в том, что подтягивают тело зародыша и используют острую иглу, проследив подчинение зародыша движению иглы. Материал можно вводить в головной мозг или определенные участки тела. При этом может быть значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.

Заражение в кровеносные сосуды ХАО

При овоскопировании 11-13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят каплю спирта, что делает прозрачной подскорлупную оболочку. Иглу вводят в сосуд, под контролем глаза на овоскопе. При этом сосуд будет двигаться при небольших боковых движениях иглы.

Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, имеют различные варианты. Зараженные эмбрионы помещают для дальнейшей инкубации в термостат (как правило, 37°С) для дальнейшей инкубации, при которой происходит репродукция внесенного вируса и накопление его. За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривая на овоскопе, отбирают павшие. Гибель в первые 24 часа после заражения считается неспецифической (обусловленной травмированием или размножением бактерий). Погибших в более поздние сроки эмбрионов переносят в холодильник с температурой 4°С, при этом сохраняется активность вируса и уплотняются ткани эмбриона.

Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса, для каждого вируса и даже штамма эти сроки варьируют от 2 до 7-8 суток (вирус инфекционного ларинготрахеита - 5 дней, ньюкаслской болезни штамм Н - 2-3 дня, штамм В, - 5 дней). Затем всех эмбрионов умерщвляют охлаждением при 4°С в течение 3-4 часов и вскрывают.