ВВЕДЕНИЕ 1 страница

Вирусология, как самостоятельная наука, сформировалась сравнительно недавно и берет свое начало с открытия Дмитрия Иосифовича Ивановского, который в 1892 году при изучении мозаичной болезни табака в Никитском ботаническом саду (в Крыму) впервые доказал, что болезнь табака вызывается фильтрующимися микроорганизмами, невидимыми под обычным световым микроскопом. Ивановский является основателем учения о вирусах - вирусологии»

Вирусология - биологическая наука, занимающаяся изучением вирусов и болезней, вызываемых вирусами. Вирусы свое название получили в те времена, когда считали, что болезнь от укуса змеи и бешеной собаки имеет одинаковую причину - попадание в организм ядовитого вещества, т. е. вируса. Слово «вирус» переводится как яд животного происхождения.

Такое название было дано, когда еще не знали, что вирусы - живые существа. Сейчас накоплен большой материал, который подтверждает, что с биологической точки зрения вирусы представляют собой простейшие формы жизни, в которых основные жизненные процессы совершаются на молекулярном уровне. Вирусы способны размножаться в живых клетках, передавать признаки по наследству и изменяться под влиянием внешних условий, следовательно, вирусы - это особая группа живых существ, простейшая неклеточная форма жизни. Из всех существ, обитающих на земле, наиболее просто организованы вирусы. Они занимают особое положение в биосфере, находясь на границе живой и неживой природы.

Один из ведущих советских вирусологов академик В.М. Жданов считает, что современные вирусы являются потомками простейших живых организмов, которые на определенных этапах эволюции приспособились к существованию за счет клеточных организмов и стали внутриклеточными паразитами.

Сейчас известно более 3000 вирусов и в том числе более 500 поражающих человека и животных»

Занятие 1. Вирусологическая лаборатория. Техника безопасности и правила работы с вируссодержащим материалом. Взятие и транспорта патологического материала для вирусологических исследований

Цель занятия: узнать цели, задачи и структуру вирусологической лаборатории, а также изучить правила и технику безопасности при работе с вируссодержащим материалом.

Оборудование и материалы: вирусологическая лаборатория кафедры с оборудованием, журнал по технике безопасности, шаблоны сопроводительных записок на патологический материал.

Теоретическая часть.

Вирусологические лаборатории или вирусологические отделы осуществляют следующие задачи:

1) лабораторную диагностику вирусных инфекций;

2) контролируют заболеваемость животных, вызываемую вирусами в межэпизоотический период;

3) учитывают состояние и напряженность постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета;

4) участвуют в организации и проведении профилактических мероприятий в борьбе с вирусными заболеваниями животных в регионе.

Лабораторию размещают в отдельно стоящем здании, а вирусологический отдел - в изолированном отсеке ветеринарной лаборатории, состоящем не менее чем из 5-6 комнат. Комнаты должны быть отдельными: для работы с вируссодержащим материалом, для постановки серологических реакций, для работы с культурой клеток, термостатная, моечная, склад. Комнаты должны быть оборудованы боксами с предбоксникам и, разделенными стеклянной перегородкой и дверью. Их оборудуют в зависимости от назначения. В боксах на столах размещают только принадлежности для работы. Поверхность столов покрывают пластиком, стеклом. Над рабочим местом устанавливают бактерицидные лампы типа БУВ-30. У входа в бокс размещают дезковрик, пропитанный дезраствором. В предбокснике размешают оборудование, соответствующее назначению бокса (микроскоп, термостат, центрифугу), здесь же хранится стерильная спецодежда, которую одевают перед работой в боксе.

Обязательным оборудованием для вирусологической лаборатории должен быть настольный бокс или бокс с ламинарной подачей стерильного воздуха - для защиты работающего от инфицированного материала.

Помещения лаборатории должны быть светлые, полы делают из плотного влагонепроницаемого материала, устойчивого к дезинфицирующим средствам (метлахская плитка, пластик, линолеум), стены, потолки покрывают легко моющимся материалом, лучше кафельной плиткой. Окна заделывают сетками для предупреждения проникновения мух и других насекомых.

При работе с вируссодержащим материалом необходимо выполнять следующие требования:

1) не допускать рассеивания вирусов во внешней среде;

2) предотвратить контаминацию (загрязнение) вируссодержащего материала посторонней микрофлорой;

3) обеспечить личную безопасность.

Работу с вируссодержащим материалом в лаборатории проводят только в спецодежде, выход за пределы лаборатории в спецодежде; вынос оборудования, инвентаря и т. д. без дезинфекции запрещен.

Весь материал, поступающий в лабораторию на исследование, должен рассматриваться как инфицированный. При распаковке поступившего материала банки обтирают снаружи дезинфицирующим средством, ставят в кюветы.

Рабочее место на столе покрывают марлей, увлажненной 5% раствором хлорамина. Переливание жидкостей, содержащих вирусы, - только над кюветой с дезередством. Использованные пипетки, предметные покровные стекла, резиновые перчатки и т. д., бывшие в употреблении, помещают в 5% раствор хлорамина, лизола, серной кислоты. Вируссодержащий материал тщательно маркируется, хранится в холодильнике и опечатывается. На этикетке указывают вирус, штамм, дату получения, объем и др. сведения, соответствующие записям в журнале.

Вирусологическая лаборатория имеет основную документацию:

- журнал вирусологических исследований;

- журнал учета выделенных вирусов и их уничтожения;

- журнал учета зараженных животных;

- журнал учета движения производственных или музейных штаммов вирусов.

Регистрируют поступающий на исследование патологический материал по сопроводительным документам в приемной.

Патологический материал поступает непосредственно в комнату для предварительной обработки (вскрывочную), там вскрывают трупы и отбирают материал для дальнейшего исследования, распределяя его по отделам, в зависимости от вида исследования. Помещение должно быть оборудовано специальным столом, инструментами для вскрытия, стерильной посудой для сбора материала, спецодеждой.

Виварий - помещение для содержания лабораторных животных; должен иметь карантинное отделение, а также изолированные друг от друга помещения для здоровых и экспериментальных животных с самостоятельными выходами. Клетки с животными снабжаются паспортом, в котором указывают дату поступления или дату заражения животного, массу, номер экспертизы и т. д.

Режим работы в вирусологической лаборатории

При работе в вирусологической лаборатории сотрудники должны строго соблюдать правила асептики и антисептики.

Асептика - система мероприятий, предупреждающих попадание микроорганизмов и вирусов в организм человека или в исследуемый материал из окружающей среды. Для этого используют стерильные инструменты и материалы, соблюдают особые санитарно-гигиенические правила работы, проводят обработку рук.

Антисептика - мероприятия, направленные на уничтожение патогенных микроорганизмов и вирусов при попадании их на кожу и слизистые оболочки. В качестве антисептиков используют различные химические вещества: 70% этиловый спирт, 5% спиртовый раствор йода, 0,5-3% раствор хлорамина, 0,5-1% раствор формалина, 0,1% раствор пер манганата калия.

В помещениях боксов ежедневно делают влажную уборку с дезсредствами (раствор хлорамина, гидроксида натрия и др.) и не реже 1 раза в неделю дезинфекцию парами формалина (30 мин 40% раствора на 1м3 помещения) или карболовой кислоты. Для работы используют только стерильные инструменты, материалы и посуду (препаровальные иглы, пинцеты, мелкий хирургический инструмент, предметные стекла, стеклянную посуду, питательные среды и т.д.). Для этого используют физические и химические методы стерилизации, а также стерильные одноразовые материалы и инструменты.

Правила техники безопасности для студентов в вирусологическом практикуме:

1. В лабораторию входить в халате, шапочке, косынке.

2. Личные вещи на рабочий стол не класть.

3. На рабочем месте соблюдать чистоту и порядок, начинать работу только с разрешения преподавателя.

4. Пользоваться только стерильными инструментами, посудой.

6. Открывать и закрывать пробирки, флаконы у пламени горелки.

7. Все отходы после занятий собирать в специально подготовленную посуду.

8. Запрещается выливать и сбрасывать отходы в раковину.

9. Если студент случайно разольет вируссодержащий материал, он обязан немедленно сообщить преподавателю и вместе с ним принять меры.

10. В конце занятия студент должен привести в порядок рабочее место, сдать дежурному весь материал, инструменты, вымыть руки и обработать дезинфицирующим материалом.

Взятие, получение и обработка патологического материала

Обнаружение вируса в организме больного животного начинают со взятия патологического материала. Патологический материал берут от больных, вынужденно убитых и павших животных. Материал берут как можно быстрее после проявления клинических признаков или не позднее 2-3 часов после смерти или убоя животного. При взятии патологического материала необходимо учитывать патогенез инфекции и тропизм вируса. От больных животных берут тот материал, в котором можно большую концентрацию вируса. Материалом для выделения вируса могут служить кровь, смывы, моча, слюна, фекалии, везикулярная жидкость, стенки афт, корочки, трахеальная слизь, конъюнктивальные выделения. От павших или вынужденно убитых животных берут: кусочки, имеющие видимые отклонения от нормы, лимфоузлы, спинной и головной мозг. Количество патологического материала должно быть достаточным для обнаружения в нем вируса (10-20 г) за исключением случаев подозрения на бешенство, когда в лабораторию отправляют голову животного. Патологический материал берут только стерильными инструментами в стерильную посуду. Взятый патологический материал необходимо законсервировать, чтобы предохранить содержащиеся в нем вирусы от инактивирования ферментами и другими агентами и защитить от действия физических факторов среды. Материал для вирусологических исследований должен быть этикетирован. На пробирки, флаконы, баночки наклеивают пластырь и пишут простым карандашом, составляют сопроводительную записку.

Этапы выполнения лабораторной работы:

1. Расписаться в журнале по технике безопасности.

2. Заполнить сопроводительную (приложение 1) на материал для вирусологических исследований.

Занятие 2. Приготовление вируссодержащего материала, очистка и концентрирование вирусов. Общие принципы лабораторной диагностики вирусных болезней

Цель занятия: освоить методику приготовления вируссодержащего материала для исследования.

Оборудование и материалы: коллекция твердых фильтров, патологический материал, раствор Хенкса, ступки, пестики, стерильный песок, центрифуга, центрифужные пробирки, стерилизатор со стерильными ножницами и пинцетами, спиртовки, стерильные ватные тампоны, пробирки типа Эппендорф.

Теоретическая часть.

В комплексную диагностику при вирусных заболеваниях включаются:

1. Эпизоотологический метод, при котором учитывают данные о заболеваемости, сезонности, наличие данного заболевания в предшествующие годы, о массовых прививках скота и его перегруппировках, о предшествующих контактах животных с источником инфекции, наличии в данной местности переносчиков возбудителя (дикие животные, насекомые, грызуны) и т. д.

2. Клинический метод, позволяющий ставить предварительный диагноз на основании типичных признаков болезни. Однако, не во всех случаях можно наблюдать четко выраженные клинические признаки, иногда болезнь может протекать скрытно (лейкоз, инфекционная анемия, плазмоцитоз и др.). При ряде вирусных болезней клинические признаки могут быть сходными, что не позволяет правильно поставить диагноз. Клинический метод диагностики нередко дополняют гематологическими исследованиями и особенно это ценно при диагностике лейкоза и инфекционной анемии.

3. Патологоанатомический метод, при котором учитывают результаты вскрытия павших животных, т. е. наличие наиболее характерных изменений в органах или тканях. Результаты вскрытия нередко дополняют данными гистологического исследования материалов.

4. Лабораторные методы диагностики. Лабораторную диагностику при вирусных болезнях проводят независимо от точности поставленного предварительного диагноза. Особенно велико значение лабораторных методов диагностики тогда, когда заболевание протекает атипично, скрытно или как смешанная инфекция.

На основании лабораторных методов диагностики ставят окончательный диагноз. При проведении лабораторной диагностики преследуют три цели:

а) обнаружить вирус в исследуемом патологическом материале, обычно путем выявления телец-включений или элементарных телец, с помощью микроскопии мазков или мазков-отпечатков в обычном световом или люминесцентном микроскопах. Иногда для этих целей применяют электронную микроскопию;

б) выделить вирусы из патологического материала путем заражения чувствительных лабораторных животных, развивающихся куриных эмбрионов и культур тканей. При необходимости проводят не менее трех пассажей;

в) идентифицировать выделенные вирусы путем постановки различных серологических реакций (РСК, РДП, РНГА, реакция нейтрализации вируса и др.) с использованием в них стандартных (биофабричных) специфических или типоспецифических иммунных сывороток. Постановкой этих же серологических реакций можно исследовать присылаемые из хозяйств сыворотки крови животных на наличие в них антител, но для этого в лаборатории нужно иметь стандартные (биофабричные) антигены - диагностикумы.

В лаборатории патологический материал освобождают от консерванта, взвешивают, измеряют и делят на 4 части: для вирусологических, бактериологических, микологических и дополнительных исследований. Затем, приняв во внимание содержимое сопроводительного письма, количество материала, его состояние и качество, составляют план исследований.

Все методы лабораторной диагностики можно разделить на три группы: экспресс методы, вирусологические методы и методы ретроспективной диагностики.

Первым этапом лабораторной диагностики является обнаружение и выделение вируса, затем его идентификация и доказательство этиологической роли. Окончательный диагноз ставится только после лабораторных исследований патологического материала.

Вируссодержащий материал очищают от крупных клеток, органов и тканей и от микрофлоры. Существует несколько распространенных методов очистки и концетрирования вируссодержащего материала:

• стерилизующее фильтрование (фильтры Беркефельда, Шамберлана, Зельца);

• центрифугирование (простое, дифференциальное, в градиенте плотностисахарозы);

• метод адсорбции;

• метод электрофореза;

• высаливание нейтральными солями.

Основные методы консервации вирусов

Вирусы выделенных или музейных штаммов следует хранить в условиях, обеспечивающих их максимальную длительную жизнеспособность. Существует несколько методов консервации вирусов:

1. Вирус хранится несколько месяцев при 4°С в 50% растворе глицерина на физиологическом растворе, который обладает бактериостатическим и защитным действием.

2. При замораживании до - 196°С (жидкий азот) с последующим хранением при этой же температуре вирус хранится несколько месяцев. При замораживании и хранении при - 20°С - 70°С вирусы быстро теряют свою инфекционность. Хорошее защитное действие при этом оказывает добавка желатина (0,5-1,5%), инактивированной сыворотки крови или обезжиренного молока.

Не допустимо повторно замораживать и размораживать вирусы, поэтому лучше их хранить маленькими порциями. Скорость оттаивания вируса (температура комнатная или на водяной бане) не влияет на его активность.

2. Вирус хранится несколько лет в лиофилизированном состоянии (высушивание в замороженном состоянии в условиях вакуума), это наилучший способ консервации.

Методика подготовки вируссодержащего материала для исследования.

Для вирусологических исследований из органов и тканей готовят вируссодержащий материал. Вирус - внутриклеточный паразит, его необходимо высвободить из клеток, перевести в суспензию. Для этого 1грамм материала измельчают ножницами, растираю в ступке со стерильным песком или битым стеклом, добавляя постепенно 10 мл физиологического раствора, фосфатного буфера или раствора Хенкса. Материал для фильтрования необходимо очистить от крупнодисперсных элементов путем предварительного фильтрования через стерильные бумажные фильтры или центрифугирования при небольших скоростях (2000-4000 об/мин). Растворы, содержащие высокие концентрации белка, перед фильтрованием целесообразно развести. Полученную 10% суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость отбирают в стерильную пробирку, добавляют антибиотик широкого спектра действия в рабочей концентрации 0,2 мл на 1 мл вируссодержащего материала.

Этапы выполнения лабораторной работы:

1. Студенты работают в парах: получают патологический материал и из него готовят по методике вируссодержащую взвесь.

2. Проводят очистку и концентрирование вируссодержащего материала.

3. Консервируют полученную суспензию методом замораживание при -18ºС.

Занятие 3. Микроскопия элементарных и внутриклеточных телец включений

Цель занятия: ознакомить студентов с методами прямого обнаружения вирусов при световой микроскопии.

Оборудование и материалы: микроскопы, вируссодержащий материал, предметные стекла, спиртовки, фильтровальная бумага, эксикаторы, мостики промывалка с дистиллированной водой, песочные часы, жидкость Руге, протрава, красящий раствор аммиачного серебра, краска Гимзе, синьки Мансона, раствор танина, спирт – ацетоновая смесь.

Теоретическая часть.

Вирион каждого вируса имеет свою форму, размеры, свойства. Встречаются вирусы, имеющие форму вирионов округлую или овальную, пулевидную (в вирионах таких вирусов нуклеопротеидный тяж свернут в клубок, одетый оболочками). Большинство вирусов животных имеют вирионы в форме многогранника, икосаэдра (в таких вирионах капсомеры уложены по кубическому типу симметрии). У некоторых вирусов вирионы не имеют четко выраженной симметрии (оспенные вирусы, Т-четные фаги). Размеры вирионов колеблются от 10 до 350 нм, поэтому они не видны в световом микроскопе (кроме вируса оспы), предельная разрешающая способность которого 300-400 нм.

Изучение морфологии вирусов - важный этап при определении таксономической принадлежности вирусов. Обнаружение (или индикация) в материале от больных животных вирионов вирусов может служить доказательством наличия вирусов в этом материале.

Обнаружение вирионов вируса в световом микроскопе называется вирусоскопией. Вирионы вирусов оспы являются гигантами среди вирионов других вирусов. Их размеры от 300 до 390 нм, поэтому их, хотя и на пределе видимости, удается увидеть в световом микроскопе.

Обнаружение в патологическом материале внутриклеточных телец-включений с определенными характеристиками позволяет судить о присутствии данного вируса в изучаемом материале. Вирусные внутриклеточные тельца-включения представляют собой либо скопление многих тысяч вирионов, либо клеточный материал, изменившийся под действием репродукции вирионов, либо избыток вирусных белков, не вошедших в состав вирионов, или комбинация всех этих элементов (чаше всего). Образуются тельца-включения при репродукции многих вирусов в клетках. Размеры их составляют от еле различимых до размера клеточного ядра. Количество их в клетке может быть от 1 до 12. Некоторые тельца-включения получили специальные названия. Так, включения, что формирует вирус бешенства в цитоплазме, принадлежащей нервным клеткам, именуемых тельцами Бабеша-Негри; образуемые в цитоплазме эпителиальных клеток вирусом оспы птиц - тельца Боллингера; оспы млекопитающих - тельца Гварниери; образуемые вирусом чумы плотоядных - тельца Лентца; образуемые вирусом инфекционного ларинготрахеита кур - тельца Зейфреда.

Как правило, РНК-содержащне вирусы образуют цитоплазматические, а ДНК-содержащие - внутриядерные тельца-включения. Небольшая группа вирусов вызывает образование телец-включений обоих типов.

Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), окрашивают различными специальными методами окраски и микроскопируют. Помимо специальных способов окраски для телец-включений разных вирусов разработаны универсальные методы, например, окраска гематоксилин-эозином. Способность к окраске, размеры, форма, структура и местоположение в клетке телец-включений специфичны у разных вирусов. Для некоторых вирусных болезней обнаружение телец-включений настолько специфично, что позволяет судить о виде инфекции и имеет значение для постановки диагноза (бешенство). В большинстве случаев это лишь вспомогательный метод диагностики вирусных инфекций.

Существует много методов окраски мазков, мазков-отпечатков. Окраска по Муромцеву. Мазки фиксируют в метиловом спирте или спирт + эфир 1-2 часа, или ацетоном 10-12 часов. Затем промывают дистиллированной водой и на 5-10 минут погружают в раствор синьки Мансона (2,0 синьки и 5,0 буры растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды), разведенной водой 1:40. После этого краску сливают и тут же мазки, не промывая водой, погружают в 10% водный раствор таннина на 8-10 минут до появления голубоватой окраски. Затем промывают водой, высушивают фильтрованной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном или спирта с ксилолом и снова высушивают фильтровальной бумагой. Заливают в канадский бальзам. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон. Ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, цитоплазма клеток бледно-голубая, а тельца Бабеша-Негри - в бледно-фиолетовый с розоватым оттенком и с темными включениями.

Окраска по Михину. Фиксированные химическим способом мазки окрашивают (после высушивания) 30-40 минут краской Гимза, разведенной 1:10 (1-2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). Затем быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96° спирта), а затем водой, просушивают фильтрованной бумагой и исследуют. Фон мазка должен быть красным с фиолетовым оттенком, нервные клетки синеватые, ядро клеток черные, а тельца Бабеша-Негри розово-красные с точечными включениями темно-синего цвета.

Самым распространённым является метод окраски по Морозову. Мазки сушат на воздухе, помещают в вертикальном положении в дистиллированную воду на 10-15 минут и красят. Для этого на фиксированный мазок на 1-2 минуты наносят жидкость Руге, затем промывают дистиллированной водой. Наносят протраву на 1-2 минуты, нагревая до отхождения паров, снова промывают. Докрашивают раствором аммиачного серебра при легком подогревании. Рассматривают препарат в иммерсионной системе. Элементарные тельца на светло - коричневом фоне препарата имеют вид темно - черных мелких зерен, образований.

Этапы выполнения лабораторной работы:

1. Каждый студент готовит мазок из вируссодержащего материала, окрашивает одним из предложенных методов, рассматривает в микроскоп.

2. Студент рассматривает готовый препарат вируса бешенства, внутриклеточные тельца Бабеша - Негри.

Занятие 4. Методы электронной микроскопии в вирусологии

Цель занятия: ознакомиться с устройством и принципом работы электронного микроскопов. Изучить приготовление препаратов для просмотра в электронном микроскопе.

Оборудование и материалы: электронный микроскоп, схема строения электронного микроскопа, вируссодержащая суспензия, сеточки с подложкой, реактивы для контрастирования, микротом, фотографии вирусов под электронным микроскопом.

Теоретическая часть.

При диагностике некоторых вирусных болезней и для изучения морфологии вирусов в настоящее время применяют электронную микроскопию. Разрешающая способность электронных микроскопов достигает 2 А (у световых микроскопов 2500 А и больше), что практически дает возможность видеть все вирусы (объекты размером до 0,2-0,4 нм). В отличие от светового в электронном микроскопе освещение идет сверху вниз и изображение получается за счет потока электронов, длина волны которых во много раз меньше длины волны света.

С целью выявления вируса в исследуемом материале препараты для электронной микроскопии готовят методом негативного контрастирования (применяется для выявления свободных частиц вируса и изучения его морфологии после очистки и концентрации вируссодержащей суспензии). Для этого медные электронно-микроскопические сеточки с коллодиевой пленкой-подложкой помещают на несколько секунд в каплю вируссодержащей суспензии. Затем промывают 2-3 каплями дистиллированной воды и подвергают негативному контрастированию. Для этого на препарат наносят каплю 10%-ного раствора фосфорновольфрамовой кислоты (рН-7,0) или 5%-ного раствора уксуснокислого уранила. Фильтровальной бумагой удаляют лишний контрастирующий раствор и сеточку просматривают в электронном микроскопе.

Используют также методы напыления с применением тяжелых металлов (золото, палладий, уран), которые распыляют в парообразном состоянии под определенным углом на поверхность исследуемого препарата. Для обнаружения вируса в клетках используют метод ультратонких срезов. Для этого вируссодержащий материал предварительно фиксируют химическими или физическими методами. Основным химическим фиксатором является четырехокись осмия, из физических фиксаторов часто применяют высушивание на воздухе и лиофилизацию. Фиксированные кусочки ткани обезвоживают в спирте или ацетоне и заливают в эпоксидные смолы (эпон, аралдит др.). Срезы толщиной 50-200 А из залитых кусочков ткани готовят на ультрамикротомах с помощью алмазных или стеклянных ножей.

Материалом для электронно-микроскопических исследований вирусов могут быть смывы из глаз, со слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, содержимое кишечника, срез пораженного участка эпидермиса кожи или оспенные корочки, кусочки органов и тканей больных и павших животных. При работе с вирусами в лаборатории исследуют вируссодержащую культуральную жидкость культуры клеток, аллантоисную жидкость куриного эмбриона, кусочки органов и тканей зараженных животных.

Этапы выполнения лабораторной работы:

1. Ознакомиться с устройством и принципом работы электронного микроскопа.

2. Работая в парах, приготовить препараты для электронной микроскопии на сеточках с подложкой.

3. Контрастировать препараты и изучить в электронный микроскоп.

Занятие 5-6. Методы люминесцентной микроскопии в вирусологии

Цель занятия: ознакомиться с устройством и принципом работы люминесцентного микроскопов. Изучить методы приготовления препаратов для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Оборудование и материалы: люминесцентный микроскоп, вируссодержащая суспензия, патматериал, набор красок для флюорохромирования, предметные и покровные стекла, фиксатор, набор сывороток для прямого и непрямого МФА.

Теоретическая часть.

Сущность явления люминесценции состоит в том, что, поглощая различные виды энергии (световую, электрическую), атомы некоторых веществ переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения. Люминесценция наблюдается в виде флуоресценции или фосфоресценции.

Люминесцентная микроскопия осуществляется с помощью специальных микроскопов, в которых используют ближнюю ультрафиолетовую или сине - фиолетовую часть спектра. В люминесцентном микроскопе используют систему светофильтров для выделения сине-фиолетовой части спектра, теплозащитные фильтры для предохранения оптики от перегревания и выцветания препаратов и запирающий фильтр на окуляре для снятия возбуждающего света и пропускания света люминесценции. Люминесцентный микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. Следует исключить вибрацию, которая создаст помехи, что особенно сказывается при микрофотографировании. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вредные газы от источника света. Лампа достигает полной силы света через 5-10 мин после включения, если сила тока при работе равна 4-5 А. Повторное включение лампы возможно только после ее охлаждения.

При люминесцентной микроскопии используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло высокого качества. В вирусологической практике люминесцентную микроскопию используют в двух основных методах: флуорохромировании и методе флуоресцирующих антител.

Метод флуорохромирования - это обработка препарата флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения препарата. Отечественная промышленность выпускает специальные наборы флуорохромов. Наиболее широко применяется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин желтый и др.) и тиозиловая группа (примулин). Флуорохром чаше всего используют в водных растворах очень низкой концентрации (от 1: 1000 до 1: 1 000 000). Метод флуорохромирования может быть использован при изучении некоторых вирусов (оспы, болезни Борна, аденовирусной инфекции и др.).

Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а рибонуклеиновая кислота - рубиново-красным.