Метод диффузии в агар

Метод основан на сравнении степени угнетения роста тест-микроба определенными концентрациями антибиотика в испытуемом материале с угнетением его роста известными концентрациями стандарта антибиотика. Подавление роста тест-микроба осуществляется за счет диффузии антибиотика из исследуемого материала в плотную среду. Рабочими стандартами служат специально изготовленные очищенные образцы антибиотиков, активность которых устанавливают по международным стандартным препаратам. Стандарты сохраняются в запаянных ампулах при температуре 4-10⁰С. На этикетках ампул указано содержание единиц или микрограммов в 1 мг препарата.

Методом диффузии в агар можно определить концентрацию всех антибиотиков, содержащихся в жидкостях (в крови, спинномозговой жидкости, моче, желчи, асцитической жидкости и т.д.) и в тканях организма (в легких, печени, почках, мозге, мышцах и др.).

Для определения концентрации антибиотика в сыворотке кровь после образования сгустка центрифугируют, сыворотку отсасывают и вносят в специальные лунки, изготовленные в агаровых пластинках, либо разводят нормальной сывороткой человека или соответствующим каждому антибиотику буферным раствором.

С целью определения концентрации антибиотиков в тканях органы после удаления остатков крови взвешивают и гомогенизируют путем растирания с кварцевым песком или в специальном смесителе. К гомогенату добавляют дистиллированную воду или соответствующий буфер. Полученную взвесь центрифугируют 30 минут при 2500-3000 об/мин. Концентрацию антибиотиков определяют в надосадочной жидкости.

Для получения воспроизводимых результатов необходима строгая стандартизация опытов. Скорость диффузии растворов в агар зависит от химической природы антибиотиков, состава и рН агаровой среды, буфера в котором готовят рабочие растворы стандарта, испытуемого материала, температуры и времени инкубации. Поэтому при определении концентрации антибиотиков в испытуемых субстратах подбирают оптимальные условия культивирования тест-культуры, оптимальные по составу и рН питательные среды, буферные растворы, обеспечивающие максимальную диффузию растворов антибиотика в среду и четкость очертания зон. Определение проводят по схеме, общей для всех антибиотиков, которая состоит из нескольких этапов.

1) Подготовка чашек со средами и тест-микробом.

С этой целью можно использовать чашки Петри с разлитыми в один или два слоя питательными средами. При этом для нижнего слоя используют «голодные» незасеянные среды, для верхнего или одного слоя агаровую среду засевают соответствующим тест–микробом. Обычно используют питательные среды, приготовленные на бульоне Хоттингера. Каждому антибиотику соответствует среда с определенным содержанием аминного азота. Например, для пенициллинов, ампициллина, тетрациклина, гентамицина, канамицина, полимиксина - 130-140 мг%, а для стрептомицина, эритромицина, олеандомицина, неомицина – 30-35 мг% аминного азота.

Среду, предназначенную для нижнего слоя, разливают в чашки Петри, которые располагают в горизонтальной плоскости, отрегулированной по ватерпасу. Нижний слой можно разливать заранее, сохраняя чашки при температуре 2-8⁰С в течение 3-5 сут. Питательную среду для верхнего слоя заражают взвесью соответствующего тест-микроба, который имеет наибольшую чувствительность к данному антибиотику. Аспорогенные культуры вносят в среду при температуре не выше 48-50⁰С, взвесь спор при 65-70⁰С. Посевная доза тест-микроба должна быть предварительно установлена для каждой серии среды, так как увеличение плотности посева может сопровождаться образованием густого микробного «газона» и уменьшением размеров зон задержки роста тест-микроба, а при недостаточном количестве засеянного микробных клеток не будет образования сплошного роста, что в дальнейшем затруднит измерение диаметра зоны подавления.

2) Приготовление рабочих растворов стандарта антибиотика и испытуемого материала.

Для приготовления растворов стандарта антибиотика делают точную навеску на аналитических весах. Навеску растворяют в соответствующем растворителе (например, для пенициллинов - буфер №1 фосфатный 1/15 М, рН 6,8-7,0, калия фосфат однозамещенный - 3,63 г, натрия фосфат двузамещенный - 7,13 г, вода дистиллированная – до 1000 мл; для ампициллина, оксациллина - 1/15 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,0; для эритромицина – 1 мл этанола на 10 мг навески, буфер №4 до 1 мг/мл; для канамицина - вода дистиллированная и т.д.) расчёта 1 мг или 1 мл или 1000 ЕД в 1 мл (основной раствор). Дальнейшее разведение основных растворов доводят до нужных концентраций.

Для стандарта каждого антибиотика определяют концентрацию раствора, обеспечивающую образование оптимальных зон задержки тест-культуры (контрольная концентрация). При приготовлении растворов испытуемого материала нужно стремиться создать концентрации антибиотиков в близких контрольной концентрации стандарта пределах. Приготовленные разведения стандарта антибиотика и испытуемого материала вносят в стерильные цилиндрики из нержавеющей стали или алюминия, расставленные по 6 в чашке на поверхности застывшей питательной среды. Вместо цилиндриков можно вносить испытуемые растворы в предварительно сделанные в толще агара лунки диаметром 8 мм или пропитывать ими бумажные диски. Однако при использовании дисков иногда получаются зоны неправильной величины и формы, что связано с неравномерной диффузией антибиотика из диска. Растворы стандарта и испытуемого образца вносят в цилиндрики или лунки специальной капельницей или пипеткой в объеме 0,1 мл, чередуя стандартный и испытуемый растворы. Для каждого испытания используют не менее 3-х чашек. Чашки инкубируют при 37⁰С в течение 16 часов, затем измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроба, образуемыми растворами.

3) Расчет активности испытуемого препарата.

Концентрацию антибиотика в испытуемом субстрате определяют по стандартной кривой. Для построения стандартной кривой используют 5 концентраций стандартного препарата. Одна из концентраций, по которой вносят поправки для всех других, является контрольной. Для каждой концентрации, кроме контрольной, используют 3 чашки (всего 12 чашек). В 3 цилиндрика или лунки каждой чашки вносят раствор контрольной концентрации, в 3 другие – одну из взятых концентраций стандарта. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны на 3 чашках, затем находят среднюю величину зоны для контрольной концентрации на всех чашках (12 х 3 = 36 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, выведенной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, определенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если отрицательная.

Пример. Средняя величина зоны контрольной концентрации 1 ЕД/мл равна 19,2 мл (выведена из 36 зон). Средняя величина зоны для той же концентрации, выведенная из 3 чашек, на которых испытывался раствор, соответствующий 0,8 ЕД/мл, равна 19 мм. Величина поправки составляет +0,2 мм. Средняя величина зоны для концентрации 0,8 ЕД/мл составляет 17,9 мм, после внесения поправки: 17,9 мм + 0,2 мм = 18,1 мм. Таким же образом исправляют значение величин зон для остальных концентраций, используемых при построении стандартной кривой.

На полулогарифмической сетке расчёта активности антибиотиков по исправленным значениям величин зон взятых концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации строят стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс величины зон против значений соответствующих концентраций на оси ординат. При постоянных условиях опыта стандартной кривой можно пользоваться длительно, проверяя угол наклона для каждой вновь приготовленной серии питательной среды по 2-3 концентрациям стандарта на 3-5 чашках.

При определении концентрации антибиотика в сыворотке или другом субстрате испытуемый субстрат разводят до предполагаемого уровня, близкого к контрольной концентрации. В зависимости от количества испытуемого материала применяют одну или несколько чашек на каждое разведение. Параллельно с испытуемым материалом на каждую чашку вносят контрольную концентрацию стандарта антибиотика. После инкубации при 37⁰С в течение 16-18 часов измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образуемые контрольной концентрацией стандарта и испытуемым раствором.

Разность между найденными средними величинами зон испытуемого образца и контрольной концентрации прибавляют к величине зоны контрольной концентрации на стандартной кривой. Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую найденной величине зоны в ЕД/мл. Умножая полученную концентрацию на степень разведения испытуемого материала, определяют содержание антибиотика в 1 мл испытуемого материала. Точность метода составляет ±10%.

При определении активности антибиотиков методом диффузии в агар ответ получают через 16-18 часов. Существуют ускоренные методы определения, с помощью которых результаты можно установить уже через 3-5 часов. Ускорение опыта достигается путем увеличения посевной дозы тест-культуры на 1 мл питательной среды, повышением температуры инкубации до 38-45⁰С или проявлением плохо видимых зон и слабо выраженных микробных газонов через 3-5 часов инкубации химическими методами. В последнем случае поверхность питательной среды обрабатывают 2% раствором красной кровяной соли и 1% раствором железо - аммиачных квасцов. Микробный газон при этом окрашивается в темно-синий цвет, на фоне которого четко вырисовываются светлые зоны подавления роста.