Метод серийных разведений

Для определения содержания антибиотика в жидкостях организма (кровь, экссудаты полостей, ликвор и др.) можно также использовать метод последовательных разведений в жидкой среде.

Питательной средой при этом служит среда Гисса с глюкозой и реактивом Андреде (рН 7,2) или фенол - сывороточная среда (2 мл

10% раствора глюкозы, 2 мл сыворотки крови человека, 6 мл дистиллированной воды и 0,25 мл насыщенного раствора фенолрота).

Среды заражают стандартизированной взвесью определенного для каждого антибиотика тест-микроба из расчета 1000-10000 микробных клеток на 1 мл среды. Зараженную среду разливают по 0,2 или 0,5 мл в стерильные пробирки. Для каждого образца готовят два ряда по 10 пробирок в каждом. Первый ряд служит для разведения раствора стандарта антибиотика (стандарт разводят до нужной концентрации сывороткой человека или здорового животного), второй – для разведения испытуемого материала (например, сыворотки). Разведения (двукратные, последовательные) испытуемого раствора и стандартного образца производят в объеме 0,2 или 0,5 мл засеянной среды. Контролями опыта служат незаражённая (контроль прозрачности и стерильности) и заражённая соответствующим тест-микробом (контроль роста микроба) среды. Результаты учитывают после 16-18 ч инкубации при 37⁰С по изменению цвета (среда Гисса становится розовой, фенол - сывороточная - из красной при рН 7,2 становится желтой за счет сбраживания растущими микроорганизмами глюкозы и изменения рН) и помутнению среды. Для того, чтобы установить концентрацию антибиотиков в исследуемой сыворотке, умножают наибольшее разведение сыворотки, задерживающее рост тест-микроба (разведение в последней пробирке с прозрачной, не изменившей цвета средой), на наименьшую концентрацию стандарта антибиотика в пробирке с отсутствием роста. Полученная величина соответствует содержанию антибиотика в 1 мл исследуемой сыворотки. Например, концентрация пенициллина в сыворотке крови определяют по следующей таблице 5.

Таблица 5. - Определение содержания пенициллина в сыворотке

В приведённом примере раствор стандарта пенициллина задерживает рост тест-микроба в концентрации 0,025 ЕД/мл, а испытуемая сыворотка – в разведении 1:8. Содержание пенициллина в неразведённой сыворотке соответствует 0,025 x 8=0,2 ЕД/мл.

Кроме определения концентрации антибиотиков в тканях и жидкостях организма, описанные микробиологические методы используют для определения активности образцов на всех стадиях производства антибиотиков, для определения стабильности антибиотиков или препаратов, содержащих антибиотики. Химические или физико-химические методы исследования количественного содержания антибиотика в препарате применяют в том случае, если получаемые результаты совпадают с результатами микробиологической оценки активности.

Разумеется, указанные методы определения антибиотикочувствительности бактерий должны проводиться в сертифицированных, аттестованных (лучше аккредитованных) микробиологических лабораториях. Однако большинство районных больниц не имеют таковых, в связи с чем ВОЗ в порядке исключения допускает возможность использования ориентировочных методов оценки антибиотикочувствительности. Например, по мазку из исследуемого материала, окрашенного по Граму, определив наличие или преобладание грамположительных или грамотрицательных бактерий, можно ориентировать клиницистов на выбор стартовой антибиотикотерапии. Допускается также (В.В. Мельникова, 1984) определение антибиотикочувствительности совокупной микрофлоры без выделения чистых культур, что занимает 18-24 часа от момента поступления материала в лабораторию. В последующие дни при наличии условий возможно более детальное исследование чистых культур бактерий с коррекцией при необходимости начатой стартовой антибактериальной терапии.

Указанные нестандартные ориентировочные методы, на наш взгляд, могут быть подспорьем в выборе стартовой антибиотикотерапии. По крайней мере это лучше, чем эмпирическая терапия «с потолка», которая, к сожалению, характерна не только для районных, но и ряда областных центров.

Таким образом, определение чувствительности возбудителей инфекционного процесса к антибактериальным препаратам является основным лабораторным методом, на основе которого осуществляется выбор оптимального и эффективного препарата для лечения.