Изучение влияния различных ферментных препаратов целлюлолитического действия и параметров ферментации на степень гидролиза ячменя и овса

Существуют различные способы повышения пищевой ценности продуктов. Наиболее актуальным на сегодняшний день является использование всех морфологических частей зерна, как наиболее богатых пищевыми волокнами и белками. Поэтому применение различных ферментных препаратов с целью частичной трансформации, приводящей к размягчению плодовой, семенной оболочек и алейронового слоя зерна, облегчает использование в производстве нешелушеного зерна.

Высокое содержание некрахмальных полисахаридов (гемицеллюлозы, целлюлозы, β - глюкана) в алейроновом слое зерна овса и ячменя определяет эффективность применения целлюлолитических ферментных препаратов. Под целлюлолитическими ферментными препаратами понимают препараты, обладающие гемицеллюлазной, пентоназной и целлюлазной активностью [5, 8, 9, 11, 27].

Из всех ферментных препаратов целлюлолитического действия выбор был остановлен на: «Biobeik-721» (в состав входят: целлобиаза, экзо - 1,4 глюкозидаза, манназа, ксилоназа. Ксиланазная активность – 721 ед/г продукта. Оптимальные условия действия – рН 3,5-5,5, температура 30-60 ^оС); «Fungamyl Super AX» (в состав входят: α-амилаза, ксиланаза. Ксиланазная активность – 2500 ед/г продукта. Оптимальные условия действия – рН 3-5, температура не выше 60 ^оС) и «Pentopan 500 BG» (в состав входят: пентозаназа, гемицеллюлаза, ксиланаза. Ксиланазная активность – 2700 ед/г продукта. Оптимальные условия действия – рН 4,5–5,0, температура 35-45 ^оС). Оптимальность выбора ферментных препаратов была основана на отсутствии β-глюканазной активности и высокой целлюлазной активностью, что позволит сохранить β-глюкан в конечном продукте, ценность которого заключается в его способности к структурообразованию пищевых масс [16].

На первом этапе исследования считали рациональным определить влияние степени увлажнения зерна на скорость диспергирования для оптимизации процесса замачивания. О скорости диспергирования судили по изменению силы тока в процессе измельчения на диспергаторе Результаты эксперимента приведены в таблице 14.

Таблица 14 – Влияние влажности зерна на скорость диспергирования.

По полученным экспериментальным данным можно сделать вывод, что скорость диспергирования увеличивается при увеличении влажности зерна. Предположительно, такое явление можно объяснить размягчением клеточных стенок зерна в процессе замачивания, что облегчает процесс диспергирования зерна. Поэтому для дальнейших исследований оптимальной влажностью зерна считали 40 %, при которой зерно диспергируется с наименьшей затратой энергии.

С целью рационального использования ферментных препаратов и установления рациональных режимов ферментации, а так же повышения экономичности технологического процесса считали целесообразным исследовать влияние параметров ферментолиза на степень гидролиза овса и ячменя.

Физико-технологические и биохимические свойства зерна оказывают решающее влияние на процессы его переработки. Наибольшую важность представляют показатели влажности и прочности зерна, влияющие на его поведение в процессе размола и способность к получению продукта высокого качества. Прочность зерна, т.е. способность сопротивляться механическому разрушению, характеризуется работой, затраченной на образование единицы площади новой поверхности или величиной разрушающего усилия при различных видах деформирования. Одной из характеристик прочности зерна является его общая деформация сжатия [22, 33].

Поэтому о степени гидролиза судили по изменению общей деформации сжатия зерна в зависимости от влажности. Ферментативный гидролиз проводили следующим образом: в связи с низкой теплопроводностью зерна предварительно подготовленные тщательно промытые в теплой воде овес и ячмень замачивали в подкисленной, с помощью лимонной кислоты, воде с рН-среды 3,0 ед. прибора и в соотношении 1:3 при температуре 40 ºС в течение 1 часа. В результате чего зерно прогревается равномерно по всему объему, а также происходит набухание целлюлозы и растворение смол, что приводит к ускорению реакции гидролиза клеточных стенок [23, 24, 25, 29, 31, 32]. Кислая реакция среды рН-среды 3 также способствует снижению микробиологической обсемененности зерна овса и ячменя [26, 28]. По истечении часа зерно промывали и замачивали при различных параметрах ферментации растворами ферментных препаратов по следующим вариантам: контроль – зерно замоченное без ферментного препарата с добавлением цитратного буфера для поддержания рН 4,5 ед. прибора; вариант 1 – «Biobeik-721»; вариант 2 –«Fungamyl Super AX»; вариант 3 – «Pentopan 500 BG». Для поддержания требуемой рН раствора использовали цитратный буфер.

По полученным экспериментальным данным оптимальной влажностью зерна для процесса максимального его диспергирования является 40 % [8, 9, 20, 29, 30, 32].

Гидромодуль является очень важным фактором, от которого зависит скорость гидролитической реакции и тем самым степень увлажнения зерна [5,8,9,10,11,17]. Поэтому считали целесообразным исследовать влияние гидромодуля на изменение влажности и общей деформации сжатия зерна овса и ячменя в процессе ферментативного гидролиза.

Данное исследование проводили при изменении соотношения зерна и воды 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 и 1:5, при длительности замачивания 90 мин, температуре замачивания 40 °С, рН-среды 4,5 ед. прибора и дозировки ферментного препарата 0,015 % по отношению к сухому веществу зерна.

Полученные результаты представлены на рисунках 2, 3, 4 и 5.

Как видно из представленных экспериментальных данных максимальной влажности и общей деформации сжатия зерно овса и ячменя достигают при гидромодуле 1:3 для всех ферментных препаратов.

Рисунок 2 – Влияние гидромодуля на изменение влажности зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.	Рисунок 3 – Влияние гидромодуля на изменение общей деформации сжатия зерна овса в процессе ферментативного гидролиза
Рисунок 4 – Влияние гидромодуля на изменение влажности зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза	Рисунок 5 – Влияние гидромодуля на изменение общей деформации сжатия зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза

Реакция среды влияет на состояние фермента и субстрата, на их сродство и соответственно скорость гидролитической реакции. При оптимальном рН-среды на поверхности ферментной молекулы реализуется такое количество и расположение разноименных зарядов, которое оптимально для гидролиза конкретного субстрата [5,8,9,10,11,17]. В связи с тем, что зона рН – оптимума фермента может быть узкой или широкой, что связано с условиями функционирования ферментов и особенностью субстратов, считали целесообразным исследовать влияние рН-среды на степень гидролиза, о котором судили по изменению влажности и общей деформации сжатия зерна в процессе ферментативного гидролиза.

Данное исследование проводили при изменении рН-среды 3,5, 4,5 и 5,5 ед. прибора, при длительности замачивания 90 мин, температуре замачивания 40 °С, дозировки ферментного препарата 0,015 % по отношению к сухому веществу зерна и гидромодуле 1:3. Активную кислотность изменяли с помощью лимонной кислоты, а поддерживали цитратным буфером.

Полученные результаты представлены на рисунках 6, 7, 8 и 9.

Рисунок 6 – Влияние рН-среды на изменение влажности зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.	Рисунок 7 – Влияние рН-среды на изменение общей деформации сжатия зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.
Рисунок 8 – Влияние рН-среды на изменение влажности зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза	Рисунок 9 – Влияние рН-среды на изменение общей деформации сжатия зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза.

Как видно из представленных экспериментальных данных наибольшую активность все ферментные препараты проявляют при рН-среды 4,5, т.к. при данной активности ферментных препаратов наблюдается увеличение влажности и общей деформации сжатия зерна овса и ячменя.

Температура является очень важным фактором, влияющий на скорость протекания отдельных стадий ферментативной реакций и на стабильность ферментов. Активность фермента наиболее высока при оптимальной температуре. Снижение интенсивности действия ферментов при повышении температуры сверх оптимальной объясняется главным образом, начинающимся разрушением (денатурацией) входящего в состав фермента белка [5,8,9,10,11,17]. Поэтому считали целесообразным исследовать влияние температуры замачивания на изменение влажности и общей деформации сжатия зерна в процессе ферментативного гидролиза.

Данное исследование проводили при изменении температуры замачивания 30 °С, 40 °С и 50 °С, рН-среды 4,5 ед. прибора, дозировки ферментного препарата 0,015 % по отношению к сухому веществу зерна, гидромодуле 1:3, при длительности замачивания зерна 90 мин.

Полученные результаты представлены на рисунках 10, 11, 12 и 13.

Рисунок 10 – Влияние температуры замачивания на изменение влажности зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.	Рисунок 11 – Влияние температуры замачивания на изменение общей деформации сжатия зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.

Данное исследование проводили при изменении длительности замачивания через каждые 30 мин, при рН-среды 4,5 ед. прибора, температуре замачивания 40 °С, дозировки ферментного препарата 0,015 % по отношению к сухому веществу зерна и гидромодуле 1:3.

Рисунок 12 – Влияние температуры замачивания на изменение влажности зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза	Рисунок 13 – Влияние температуры замачивания на изменение общей деформации сжатия зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза.

Полученные результаты представлены на рисунках 14, 15, 16 и 17 .

Рисунок 14- Влияние длительности замачивания на изменение влажности зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.	Рисунок 15-Влияние длительности замачивания на изменение общей деформации сжатия зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.

По результатам экспериментальных данных установили, что оптимальную влажность и соответствующую ей общую деформацию сжатия зерно овса достигает через 60 минут с ферментными препаратами «Pentopan 500 BG» и «Fungamyl Super AX», через 120 минут с ферментным препаратом «Biobeik 721»; зерно ячменя оптимальную влажность с соответствующей общей деформацией сжатия достигает через 120 минут с ферментными препаратами «Pentopan 500 BG» и «Fungamyl Super AX», через 180 минут с ферментным препаратом «Biobeik 721».

Рисунок 16 – Влияние длительности замачивания на изменение влажности зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза	Рисунок 17 – Влияние длительности замачивания на изменение общей деформации сжатия зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза.

Большое влияние на скорость ферментативной реакции оказывает дозировка ферментного препарата, чем она выше, тем выше скорость реакции и тем больше субстрата может подвергнуться гидролизу, но чрезмерное его количество ведет к снижению экономических показателей [5,8,9,10,11,17]. Поэтому считали целесообразным на следующем этапе исследовать влияние дозировки ферментного препарата на изменение влажности зерна овса и ячменя в процессе ферментативного гидролиза.

Данное исследование проводили при изменении дозировки ферментного препарата 0,01 %, 0,015 % и 0,02 % к массе сухого вещества зерна, рН-среды 4,5 ед. прибора, температуре замачивания 40 °С, гидромодуле 1:3, при длительности замачивания: зерна овса контроль – 120 мин, для вариантов 2 и 3 - 60 мин и для варианта 1 - 120 мин; зерна ячменя контроль – 180 мин, для вариантов 2 и 3 - 120 мин и для варианта 1 - 180 мин соответственно.

Полученные результаты представлены на рисунках 18, 19, 20 и 21.

Рисунок 18– Влияние дозировки ферментного препарата на изменение влажности зерна овса в процессе ферментативного гидролиза.	Рисунок 19 – Влияние дозировки ферментного препарата на изменение общей деформации сжатия зерна овса в процессе ферментативного гидролиза
Рисунок 20 – Влияние дозировки ферментного препарата на изменение влажности зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза.	Рисунок 21 – Влияние дозировки ферментного препарата на изменение общей деформации сжатия зерна ячменя в процессе ферментативного гидролиза

Как видно из представленных экспериментальных данных оптимальную влажность зерно овса и ячменя с соответствующей деформацией сжатия достигают при дозировке ферментных препаратов 0,015 % к массе сухого вещества зерна для всех ферментных препаратов.

На основании проведенных исследований были определены оптимальные параметры ферментативного гидролиза ячменя и овса, приведенные в таблице 15.

Таким образом, применяя данные условия ферментативного гидролиза, можно рационально использовать ферментные препараты, так как оптимальную влажность 40 % зерно достигает быстрее чем контроль, это можно объяснить действием ферментов целлюлолитического действия, за счет увеличения проницаемости клеточных стенок овса и ячменя.

Таблица 15- Оптимальные параметры ферментативного гидролиза ячменя и овса.

Вносимые при замачивании зерна ферментные препараты целлюлолитического действия воздействуют на компоненты перифирических слоев зерновки, осуществляют мягкий гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз и изменяют их структуру, т.е. переход из кристаллического состояния в аморфное при этом способствуют более быстрому движению влаги. Происходит диффузный перенос воды из алейронового слоя и зародыша внутрь эндосперма. Разрыхляется эндосперм, образуются в нем микротрещины [9, 10, 11, 13, 17, 27].

На следующем этапе экспериментальной работы исследовали степень ферментации зерна овса и ячменя при оптимальных условиях для ферментных препаратов с целью определения более эффективнного ферментного препарата. О степени гидролиза судили по изменению количества: гемицеллюлозы, сухих веществ в растворе и влажности зерна.

Результаты эксперимента представлены в таблицу 16.

Таблица 16 – Влияние различных ферментных препаратов на степень гидролиза ячменя и овса при оптимальных условиях.

Из приведенных экспериментальных данных можно сделать вывод, что содержание гемицеллюлозы уменьшилось по отношению к контролю у зерна овса и ячменя:

- для «Biobeik 721» на 4,2 и 6,7 % соответственно;

- для «Fungamyl Super AX» на 5,7 и 9,3 % соответственно;

- для «Pentopan 500 BG» на 6,8 и 11,3 % соответственно.

Содержание сухих веществ в воде увеличивается, данное явление, предположительно, можно объяснить появлением водорастворимых веществ в растворе в результате ферментативного гидролиза клеточных стенок зерна и увеличения их проницаемости.

С помощью компьютерного комплекса, состоящего из светооптического микроскопа Axiostar+ (Carl Zeiss), компьютера и цифровой фотокамеры были получены изображения срезов зерна овса и ячменя, которые показали, что под действием ферментных препаратов произошло сглаживание поверхности зерна за счет частичного разрушения полисахаридного комплекса матрикса клеточных стенок. Слои плодовой оболочки связаны не прочно, при увлажнении и ферментативном гидролизе отдельные волокна дефибриллируются и расстояние между молекулами увеличивается, через которые ускоряется процесс диффузии воды в более глубокие слои зерна. Периферические слои плодовой оболочки зерна незначительно отходят от зерновки. В целом зерно приобретает несколько искаженные очертания, оболочки размягчаются. Под действием ферментных препаратов, плодовая оболочка равномерно отделяется от семенной части и приобретает более рыхлую структуру. Плодовая и семенная оболочки претерпевают резкие изменения, связанные с набуханием зерновки и с воздействием растворов ферментных препаратов целлюлолитического действия. Оболочки зерна выполняют защитную функцию. Они представляют собой сложные образования, их делят на плодовые и семенные. Плодовая оболочка (перикарпий) состоит из наружного и внутреннего типов клеток. Наружный слой представлен эпидермисом, гиподермисом и остатками тонкостенных клеток. Внутренний слой включает: продольные, поперечные и трубчатые клетки. Семенная оболочка (перисперм) также состоит из нескольких слоев клеток: тесты, покрова, спермодермы и пигментного тяжа [66].

Таким образом, в результате проведенных исследований установили, что наиболее эффективным ферментным препаратом, с точки зрения рационального его использования, для овса и ячменя является «Pentopan 500 BG», т.к. при применении этого ферментного препарата гидролиз зерна протекает быстрее, что не приводит к значительному изменению количественного и качественного состава плодовой и семенной оболочки зерна, в связи с этим диспергирование зерна происходит с наименьшей затратой энергии [13, 14].