Применение ферментолиза при биоконверсии зернового сырья

При производстве пищевых продуктов используются различные виды биологического сырья, в том числе и зерновое, что предопределяет важную роль ферментов в процессе его переработки.

Биоконверсия, или биотрансформация – это превращение одних органических соединений в другие под действием ферментных систем микроорганизмов. Превращению могут подвергаться как продукты жизнедеятельности микроорганизмов, так и специально вводимые в среду вещества. Классическим примером биоконверсии зерна служат процессы получения продуктов брожения: спиртов, пива, органических кислот и т.д.

Большинство промышленно важных процессов биоконверсии осуществляется путем многоступенчатого превращения субстрата в конечный продукт с участием нескольких ферментов или ферментных систем. Технологическое преимущество биоконверсии по сравнению с процессами химических превращений веществ состоит в том, что необходимые катализаторы синтезируются культурой микроорганизма или применяют выделенные из них ферменты, и конверсия может осуществляться в одну технологическую стадию.

Биоконверсия позволяет получить продукты точного химического состава с заданными функционально технологическими свойствами.

Производство спирта основано на конверсии зернового сырья по средством ферментолиза. Для получения высокого выхода спирта необходимо полностью гидролизовать крахмал микробными ферментами - α-амилазой и глюкоамилазой, а так же солодом.

Применение α-амилазы на стадиях разваривания и осахаривания позволяет снизить вязкость замесов, достичь высокой полноты клейстеризации крахмальных гранул, предотвратить ретроградацию крахмала, препятствующую его осахаривавию. Для разжижения крахмала целесообразно применять препараты термостабильной α-амилазы, которые выделяют из культуры В. licheniformis (Термамил, Така-Терм, Зимаджунт, отечественный препарат Амилолихетерм). Различные штаммы названной бактерии продуцируют амилазу с оптимумом действия в интервале от 76 до 95° С. В средах с высокой концентрацией крахмала, в присутствии микродобавок соли СаСI2, Термамил стабилен в течение 3 ч при 100° с.

С помощью термостабильных амилаз можно осуществлять непрерывный процесс клейстеризации -разжижения, вплоть до температуры полной желатинизацив крахмальных гранул. Совмещение разжижения и разваривания существенно повышает эффективность процесса. Непрерывный гидролиз клейстеризующегося крахмала, переход продуктов реакции в раствор способствуют более быстрому набуханию крахмала во внутренних областях частиц сырья. За счет этого может быть сокращена продолжительность процесса, а его максимальная температура понижена до 110-115°С (температуры полной желатинизации крахмальных гранул). При использовании термостабильной амилазы существенно снижается расход фермента на единицу сырья. При замене Амилосубтилииа ГЗх на Амилолихетерм ГЗх дозировку амилазы удалось снизить в 1,5 раза без снижения выхода спирта. Оптимальная доза Амилолихетерма составила 1 ед/г крахмала (0,3 ед/г на стадии разжижения и 0,7 ед/г на стадии осахаривания в сочетании с 6 ед/г глюкоамилазы), тогда как доза Амилосубтилина - 1,5 ед/г крахмала (соответственно по стадиям 0,5 и 1,0 ед/г).

Ферментные препараты с относительно низкой оптимальной температурой действия целесообразно использовать на стадии осахаривания. Это относится к препаратам с основной активностью α-амилазы (Амилосубтилину, Амилоризину, солоду) и препаратам глюкоамилазы. Амилолитический комплекс солода и грибная α-амилаза более глубоко расщепляют крахмал, чем бактериальная α-амилаза, но полное осахаривание достигается только с помощью глюкоамилазы. Применение микробной глюкоамилазы позволяет увеличить степень сбраживания на 1,3—1,5% по сравнению с вариантом осахаривания солодом.

В качестве препаратов глюкоамилазы обычно применяют Глюка ваморин Гх или Амилоглюкаваморин Гх (культуральную жидкость гриба Asp. awamori, получаемую в ферментных цехах спиртзаводов). Оптимум действия Глюкаваморина (рН 4—5,5) соответствует активной кислотности бражки (рН 4,2—5,2). Это существенно, поскольку на стадии осахаривания сырья, в закрытой системе, где из сферы реакции не выводится глюкоза, процесс гидролиза крахмала проходит не полностью. Он продолжается в процессе брожения, по мере потребления глюкозы дрожжами что сдвигает равновесие реакции гидролиза катализируемой глюкоамилазой. Общая продолжительность брожения зависит от дозировки глюкоаммлазы. При регламентированном соотношении 6 ед. глюкоамилазы на 1 г крахмала сырья брожение длится 72 ч, при повышении дозы до 15 ед/г крахмала процесс заканчивается за 48 ч.

Применение микробной глюкоамилазы дает возможность использовать солод того же вида зерна, что и в сырье (что не допускается регламентом). Это показано в производственных опытах, проведенных на двух спиртзаводах где осахаривание ячменного замеса проводили ячменным солодом и Глюкаваморином Гх (7,5% солода + 5 ед. глюкоамилазы на 1 г крахмала или 5% солода в 4 ед. глюкоамилазы на 1 г крахмала). При осахаривании зерновых замесов сочетанием солода в глюкоамилазы соотношение этих компонентов влияет на органолептические показатели. Спирт наилучшего качества получен при осахаривании 7,5 % ячменного солода ( в виде солодового молока) и Глюкаваморином Гх в дозе 3 ед. на 1 г. крахмала. Для замеса из ячменя оптимальный состав осахаривающей смеси-5% солода и 4 ед. глюкоамилазы/г крахмала. В опытах использовали солод с активностью α-амилазы 25—30 ед/г по капельному методу. Учитывая колебания активности солода и качества сырья, необходимо проводить контрольные опыты по выбору наилучших осахаривающих композиций.

. Существенным резервом сбраживаемых углеводов являются некрахмальные полисахариды — целлюлоза, β-1,3-1,4-глюкан, ксилоглюкан и другие разновидности гемецеллюлоз, в состав которых входит глюкоза. За счет сбраживания глюкозы некрахмальных полисахаридов выход спирта из зернового сырья может быть повышен на 10—12%.

Гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз не только дает непосредственно сбраживаемую глюкозу, но и повышает доступность крахмала ферментативному гидролизу. В этом смысле особенно важно гидролизовать β-1,3-1,4-глюкан, который является существенным элементом клеточных стенок эндосперма злаков (у ячменя и овса глюкан составляет 75% массы клеточных стенок эндосперма). В свою очередь, гидролиз крахмала способствует повышению доступности целлюлозы, и в присутствии амилолитических ферментов степень расщепления целлюлозы несколько повышается. Поэтому цитолитические ферментные препараты целесообразно применять на стадии осахаривания замесов, совместно с α-амилазой и глюкоамилазой.

При испытании отечественных ферментных препаратов (Целлофторина ГЗх, Целлобранина ГЗх, Ксилоглюканофоетидина П10ч и Целлюлозы - 100) по их способности гидролизовать целлюлозу и гемицеллюлозу обогащенных этими полимерами фракций зерна установили, что оптимальная дозировка целлюлозы составляет 14—16 ед/г субстрата, гидролиз при 60° С заканчивается за 2—4 ч расщеплением около 50% целлюлозы. Для обработки ржи и ячменя целесообразно использовать Ксилоглюканофоетидин, пшеницы — Целлофторин. При совместном гидролизе сырья целлюлазами, α-амилазой и глюкоамилазой степень гидролиза целлюлозы увеличивается до 55—60%, β-1,3-1,4-глюкан гидролизуется на 95—98% до глюкозы, прочие гемицеллюлозы — на 80—90%, с образованием пентоз и глюкозы.

В пивоварении ферменты играют ключевую роль. Классическая технология пива основана на использовании ферментов ячменного солода и дрожжей сахаромицетов. В солоде присутствуют гидролитические ферменты, необходимые для перевода в растворенное состояние основных групп полимеров: крахмала, некрахмальных полисахаридов и белка. В отличие от спиртового производства в пивоварении не стремятся достич максимального возможной степени расщепления полимеров сырья, поскольку для создания вкуса и аромата пива необходимы продукты непоного гидролиза крахмала, глюкана и белков. Пиво лучших сортов вырабатывается из солода без примесей несоложеного сырья. При замене значительной части солода несоложенным ячменем снижение ферментативной активности можно компенсировать введением мультиэнзимных композиций (МЭК), в состав которых входят Амилосубтилин, протосубтилин и Амилорезин. Обязательными в пивоварении являются ферменты α-амилаза, β-глюканаза и пептидаза. Для совершенствования технологии пива используюи МЭК с высокой активностью ферментов, расщепляющих некрахмальные полисахариды – Целловиридин, Ксилаком, Целлоконингин, Целлокандин, Цитореземин. Применение данных ферментных препаратов позволяет сократить процесс осахаривания, снижает вязкость сусла, увеличивает выход экстракта и конечной степени сбраживания.

Стабилизация пива – основная задача, решаемая с помощью ферментов. В основе коллоидного помутнения пива при охлаждении лежит образование комплекса нейтральных полисахаридов, белков, полифенолов и ионов поливалентных металлов. Для углеводов в коллоидных частицах мути до 80 % принадлежит глюкану. В белковый компонент частиц входит β-глобулин, альбумин гордеин ячменя. Для предотвращения помутнения пива необходимо гидролизовать полимеры. С этой целью используют Протосубтилин, Амилорезин, Пектофоетидин, Коллагеназу и папаин.

Ферменты могут найти применение для стабилизации пива от помутнений микробиологического происхождения. Повышение биологической стойкости возможно за счет лизиса бактериальной и дрожжевой микрофлоры пива. В качестве препарата литических пептидаз выступает – Лизосубтилин, Фермосорб, проторезин, Протосубтилин.

Ферментными методами получают различные виды сахаристых продуктов, используя в качестве сырья крахмал, зерно злаков, инулинсодержащее сырье и т.д.

В России потребность в сахаросодержащих продуктах удовлетворяется в основном за счет выработки сахара из свеклы или тростникового сахара-сырца, крахмальных паток. Большинство существующих технологий получения паток, глюкозы, глюкозно-фруктозных сиропов основаны на переработке крахмала различного происхождения.

В качестве сырья для производства сахаросодержащих продуктов используют различные злаки, в основном пшеницу, кукурузу, рис, крахмалсодержащие корнеплоды [58]. Большой интерес с точки зрения рационального использования сырья представляет выявление дополнительных источников крахмалсодержащего сырья.

Существующие технологии получения сахаросодержащих продуктов связаны с выделением крахмала и последующим его гидролизом в присутствии катализаторов – кислот, ферментов и кислотно-ферментативным путем. Независимо от вида катализатора процесс гидролиза крахмала условно делится на три стадии: клейстеризации, разжижения и осахаривания. Почти всегда стадия клейстеризации совмещена с разжижением, когда под действием катализатора разрушаются зерна крахмала и длинные цепочки молекул образующих крахмала, перешедшие в результате клейстеризации в высоковязкий клейстер, разрываются на более короткие, что приводит к снижению вязкости в несколько тысяч раз. В разжиженном субстрате с низкой вязкостью легче проходят дальнейшие процессы расщепления высокомолекулярных полисахаридов вплоть до образования простейших сахаров.

Применение кислотного гидролиза имеет целый ряд недостатков – загрязнение гидролизатов продуктами реверсии и термического разложения углеводов, не достигается полное осахаривание, что приводит к снижению выхода глюкозы, имеют место большие затраты и дорогостоящее оборудование.

До 1960 г все виды сахаросодержащих продуктов, включая товарную глюкозу, получали кислотным гидролизом крахмала [42, 178]. В 1959 г в Японии был впервые применен ферментативный способ гидролиза крахмала и к концу 1960 г вся промышленность этой страны, производящая сахаросодержащие продукты, была переведена на ферментативный гидролиз [217].

В современном мире широкое распространение получили глюкозно-фруктозные сиропы при гидролизе крахмала с последующей изомеризацией глюкозы во фруктозу ферментным препаратом глюкозоизомеразой [88].

На сегодняшний день широкое распространение и применение в пищевых технологиях глюкозно-фруктозных сиропов из крахмалсодержащего сырья получило в США, Японии, Канаде, Южной Кореи, Аргентине, Венгрии, Югославии, Китае, Индонезии [85].

Высокоосахаренная патока, полученная ферментативным способом, имеет ряд преимуществ перед патокой, полученной кислотным гидролизом. Так обычная патока с глюкозным эквивалентом 60 % и выше имеет ограниченное применение вследствие значительного содержания декстринов, наличия таких сахаров как гентобиоза, изомальтоза, паноза, которые не сбраживаются дрожжами, а также высокой цветности и горьковатого привкуса, что затрудняет их применение в хлебопечении. Кроме того, при хранении патока склонна к кристаллизации.

Первые исследования по разработке способа получения патоки с высоким содержанием сбраживаемых сахаров и низкой кристаллизационной способностью с применением ферментов микробного происхождения были проведены в Японии и США. Они предусматривали разжижение крахмала с помощью α-амилазы или кислоты и осахаривание комплексом ферментов, обеспечивающих получение паток с заданным углеводным составом. Для осахаривания применяли грибную амилазу, бактериальную β-амилазу, глюкоамилазу в сочетании с ферментами солода. При этом получали сахаросодержащие продукты с глюкозным эквивалентом 58-71 %, содержанием мальтозы 44-61 %, сбраживаемых углеводов 60-80 % [158].

Известен способ получения патоки с высоким содержанием мальтозы (до 90 %) путем гидролиза крахмала с помощью β-амилазы и амилазы, полученной из Streptomyces [158].

Технология переработки крахмала до сахаросодержащих продуктов требует высокой очистки крахмала. При выделении и очистке крахмала неизбежны потери значительного количества ценных в пищевом отношении компонентов растительного сырья, большие материальные и энергетические затраты. В связи с этим в последнее время внимание исследователей направлено на разработку ферментативных способов гидролиза крахмала путем переработки цельного растительного сырья, исключающих стадии предварительного выделения крахмала [93, 133].

При производстве глюкозно-фруктозного сиропа суспензия очищенного кукурузного крахмала разжижается ферментным препаратом бактериальной α-амилазы и осахаривается глюкоамилазой до получения гидролизата с содержанием редуцирующих сахаров 97-98 %. Полученный гидролизат очищают от жиробелковой взвеси, а затем удаляют красящие вещества обработкой активированным углем с последующей очисткой и деминерализацией сиропов на ионообменных смолах. Сироп уваривается под вакуумом до концентрации 40-50 %, после чего направляется на изомеризацию с применением препаратов иммобилизованной глюкозоизомеразы [86].

Известен способ получения глюкозного сиропа путем дробления риса, вымачивания его в водном растворе диоксида серы, промывания водой для удаления растворившихся компонентов, обработки ферментным препаратом α-амилазы для разжижения крахмала, а затем осахаривания глюкоамилазой при рН 5,0-6,0 и длительности гидролиза, необходимой для получения определенного содержания глюкозы в продукте [93].

Представляет интерес технология переработки муки из целого зерна злаков, которая предусматривает получение водно-мучной суспензии с содержанием сухих веществ 30-50 %и рН 5,0-7,0, проведение гидролиза ферментными препаратами, выбор которых и условия проведения определяются свойствами и составом сырья и заданного состава конечного продукта. Процесс клейстеризации и разжижения крахмала проводится в присутствии термостабильного ферментного препарата α-амилазы из Termamyl-120 путем нагревания суспензии прямой инъекцией пара при интенсивном перемешивании. Полученный по окончании процесса гидролизат содержит большое количество мальтозы и мальтотриозы и после инактивации фермента может использоваться в хлебопечении. Возможно отделение нерастворимой фракции, состоящей в основном из белка и клетчатки [205].

Существует и другой способ получения сахаросодержащего сиропа непосредственно из крахмалсодержащего сырья. Мука из целого зерна злаковых суспензируется с водой в соотношении 1:2, подвергается воздействию α-термомил бактериального происхождения для снижения вязкости в течение 1 часа при 50 ºС. Затем суспензию подвергают клейстеризации и разжижению препаратом α-амилазы при 95 ºС в течение 1 часа. После чего смесь разделяют на жидкость и твердую фазу в центрифуге при 95 ºС. Твердая фаза высушивается и перерабатывается в муку с высоким содержанием белка, а в жидкую фазу вводят препарат глюкоамилазы и проводят гидролиз при рН 4,5, добавляя серную кислоту, при температуре 60 ºС в течение 40-47 часов. В конце осахаривания глюкозный эквивалент составляет 90 %. Действие на гидролизат препаратам глюкозоизомеразы приводит к получению глюкозно-фруктозного сиропа [206].

Разработана технология, позволяющая осуществлять прямой гидролиз крахмалсодержащих свежих и высушенных корней кассавы (маниока). Предварительно измельченные корни кассавы смешивают с водой, отделяют твердую фазу центрифугированием, что позволяет удалить часть растворимого белка и снизить цветность готового продукта. Затем проводят клейстеризацию при температуре 90-96 ºС, разжижение препаратом α-амилазы и осахаривание глюкоамилазой. Затем отделяют твердую фазу, и сироп очищают активированным углем [207].

Существуют разработки технологий получения фруктозных сиропов из инулинсодержащего сырья – топинамбур, георгин, цикорий [3, 4, 12, 25, 82].

Представляет интерес способ получения сиропа из сахарного сорго, предусматривающий температурную коагуляцию несахаров, клейстеризацию крахмала и его ферментативное расщепление с помощью амилолитических ферментов, обработку активированным углем и двухстадийное сгущение сока с промежуточным фильтрованием [49,82, 93].

Существуют работы по получению высокоосахаренных глюкозных гидролизатов из пшеничной муки. Степень осахаривания крахмала достигает 85,5 % [8, 10].

Известен способ получения сахаросодержащего продукта из измельченного до муки зерна ржи, предусматривающий смешивание его с водой при соотношении 1:3 до образования суспензии, разжижение последней амилолитическими и цитолитическими ферментами муки при ее подогреве до 80 ºС со скоростью 1 ºС/ мин с 30-минутными паузами при 40 ºС, 60 ºС, 70 ºС, термообработку продукта при температуре 120-125 ºС в течение 2-3 мин [119]. Ферментолиз проводят композицией ферментных препаратов, содержащей цитазу с высокой ксилоназной активностью в количестве 0,5-0,7 единиц цитолитической активности/г безводной муки, грибную α-амилазу в количестве 2-2,5 единиц амилолитической активности и/или глюкоамилазу в количестве 0,5-1,5 единиц глюкоамилазной активности/г крахмала муки. Процесс проводят при температуре 55-57 ºС, рН-среды 5,3-5,5 в течение 16-20 часов, после чего гидролизат нагревают до 80 ºС для инактивации ферментов.

Известен способ получения сахаросодержащего продукта, предусматривающий смешивание ржаной муки с водой при их соотношении 1:3 до образования суспензии, разжижение последней амилолитическими ферментами муки при температуре 56-65 ºС и рН-среды 4,5-5,0 в течение 10-30 мин, гидролиз разжиженной суспензии ферментом до заданного содержания редуцирующих веществ и инактивацию фермента [118]. Для гидролиза используют фермент глюкоамилазу в количестве 4,0-7,0 единиц глюкоамилазной активности/г крахмала муки, и процесс ведут в течение 5,0-22,0 ч при температуре 56-65 ºС.

Существует технология получения сахаросодержащей пасты из картофеля и сахарной свеклы методом ферментативного гидролиза с помощью ферментного препарата АМГ при температуре 45 °С, концентрации 20 %, рН 6,4, дозировка ферментного препарата 0,03-0,05 % от массы сырья, продолжительность осахаривания 3-4 часа [23, 77, 148].

Известен способ получения гидролизата из мезги топинамбура с содержанием редуцирующих веществ 42,75 %. Процесс биоконверсии проводят с применением композиции ферментных препаратов Пектофоетидин П 10Х в дозировке 3,6 ед/г и Целлобранин Г 3Х в дозировке 2,9 ед/г при температуре 50 ºС в течение 6 часов. Применение данного гидролизата в хлебопечении способствует интенсификации процессов газообразования и кислотонакопления в тесте, сокращению продолжительности созревания теста на 30-40 минут, повышению пищевой ценности и качества готового хлеба [133].

Представляет интерес способ производства сахаросодержащего гидролизата из муки амаранта. В водно-мучную суспензию из муки амаранта и воды в соотношении 1:2 вносят 0,25-0,35 % Амилосубтилина Г 10 Х от массы крахмала в муке. Суспензию быстро нагревают до температуры 85-95 ºС и выдерживают в течение 15 минут, после чего гидролизат охлаждают до температуры 60 ºС и вносят Глюкоаваморин П 10 Х из расчета 180-220 ед на 1 г крахмала муки амаранта. Осахаривание проводят в течение 4 часов при 60 ºС. Также, возможно получение гидролизата из шрота семян амаранта, после получения из него белоклипидного комплекса [99, 133].

На основе проведенного анализа литературных источников, можно сделать вывод, что основная масса сахаросодержащих продуктов производится из выделенного и очищенного крахмала различных культур и в меньшей степени из целого зерна и муки из него, потому существующие технологии не способствуют получению продуктов высокой пищевой ценности, к тому же они достаточно длительны и некоторые виды сырья малодоступны для Российского производителя. Поэтому исследования должны быть направлены на изыскание новых видов местного крахмалсодержащего сырья и разработку технологий производства новых сахаросодержащих продуктов с высоким их выходом.