Разделение гемоглобина и теней эритроцитов

1. Добавить к осадку ФЭК 2 объема дистиллята и 1 каплю хлороформа для ускорения осмотического гемолиза.

2. Закрыв горло пробирки пробкой, обернутой полиэтиленовой пленкой или алюминиевой фольгой, энергично встряхнуть ее содержимое и поставить пробирку в штатив на 30 мин., периодически встряхивая для ускорения полноты гемолиза.

3. Уравновесив пробирки на центрифужных весах аналогично пп. 2-7 работы 6.3.1, центрифугировать гемолизаты 20 мин. при 2000 об/мин.

4. Красный надосадок водного раствора гемоглобина количественно перенести в чистую, четко промаркированную пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение в холодильнике лаборанту, для работ на следующих занятиях.

5. Перевернув пробирку вверх дном, подсушить плотный белесый осадок на фильтровальной бумаге.

6. Аналогично п. 4 данной работы, четко маркировать пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение лаборанту, как препарат теней (уст. – стромы) эритроцитов. При желании, небольшую часть материала стоит микроскопировать с большим увеличением.

6.3.3. Высаливание белковых фракций плазмы крови и их

количественная нефелометрия

Основаны на способности белков, в зависимости от прочности их гидратных оболочек, оседать из раствора при определенных концентрациях фосфатных солей. Степень помутнения растворов, определенная нефелометрией на ФЭКе КФК-2, пропорциональна содержанию белка в соответствующей фракции.

1л основного фосфатного буферного раствора содержит: 67 г. NaOH и 463,6 г. К₃РО₄. Соотношение объемов рабочих буферных растворов – в таблице 6.1.

Таблица 6.1

Состав рабочих буферных растворов.

1. В соответствии с таблицей 6.2 поместить в 6 пронумерованных центрифужных пробирок:

Таблица 6.2.

Состав проб, мл для высаливания белковых фракций плазмы

2. Пробы тщательно перемешать и, точно через 15 мин с момента добавки препаратов, измерить величины А растворов на ФЭКе с красным светофильтром, в кювете толщиной 5 мм против контроля. 3. Убедившись в надежной маркировке проб, плотно закрыть их пробками и сдать образца на хранение лаборанту для работы на следующих занятиях.

4. Для каждой фракции белков плазмы рассчитать истинное значение А по формулам: Сывороточный альбумин = СА = А3 - А4;

α–глобулины = А4 - А5;

β–глобулины = А5 - А6;

γ–глобулины = А6.

5. Полученные истинные значения А для всех фракций суммировать и, приняв найденную величину за 100 %, рассчитать по формуле:

В норме, плазма крови млекопитающих содержит 60-80 г/л белка, из которых 35-50 г/л СА и 25-30 г/л глобулинов. Т.е. отношение альбумина к глобулинам = индекс А/Г лежит в пределах 1,5-2,3. Отсюда, относительное содержание CА в плазме крови составляет 55%, α–глобулинов – 10-18%, β–глобулинов – 8-14% и γ – глобулинов – 12-22%. Данные величины, как важнейшие константы гомеостаза, изменяются лишь при тяжелых кровопотерях, воспалительных и инфекционных заболеваниях и, крайней степени белкового голодания – маразме.