МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ

7.1. Общие замечания.Известно, что белки составляют половину и более сухой массы большинства клеток. Пластичность их полипептидной структуры позволяет белкам играть роль главных «молекулярных машин» в любой клетке и организме. Наконец белки – важнейший источник азота в питании, а, следовательно, росте и развитии консументов. Поэтому определение белка играет первичную = опорную роль во всех количественных исследованиях по энзимологии и биологии клеток, служит основой оценки физиологии и патологии организмов и их популяций, а также – важнейшим критерием оценки качества = эффективности пищевых цепей.

Соответственно задачам и возможностям лабораторий, методы измерения концентрации белков (табл. 7.1) многочисленны и разнообразны. Очевидно, что рефрактометрия (лат. Refractus – преломление) позволяет быстро и просто определять процентные концентрации белка в двухкомпонентных растворах. Гравиметрия – зависит от чувствительности лабораторных весов и требует чистого препарата, высушенного до постоянной массы. Принцип и формула расчета фотометрии белков в УФ, уже приводились в таблице 4.3.

Таблица 7.1

Методы измерения концентрации белков

До 70-х гг. прошлого века, наиболее точным (10^-5 г/л), считалось определение белка по количеству азота. Исходя из того, что в подавляющем большинстве белков, за исключением гистонов и протаминов, содержание азота близко к 16 %, считалось достаточным умножить найденную величину на эмпирический коэффициент 6,25 и, получить содержание белка в препарате. Однако, необходимость минерализации препарата в серной кислоте и последующее определение аммиака, занимали часы-сутки. Из-за длительности и трудоемкости этих процедур, сейчас этот метод применяют редко. По близким причинам, измерение концентраций белка на основе анализа аминокислот, используют лишь в специализированных лабораториях.

С 50-х гг. ХХ в., чаще всего в биохимической литературе цитировали работу Lowry и соавторов, предложивших измерять концентрации белков сочетанием биуретовой реакции с реактивом Фолина-Чиокалто (1927), дающим интенсивную темно-синюю окраску с тирозином, фенилаланином и, меньше с такими аминокислотами, как Три, Гис, Цис. К сожалению, его линейность, сохраняется лишь в узком диапазоне концентраций. Большинство модификаций этой методики сводится к попыткам устранить влияние специфических реагентов, применявшихся при выделении белков. В последние годы появились методы связывания красителей и флуорометрии, если в белке имеется, или, без потери нативных свойств, в него вводится соответствующий маркер. Достоинства и недостатки этих методов сведены в таблицу 7.2.

Таблица 7.2

Сравнение достоинств и недостатков методов измерения количества белка (По Р. Скоупс, 1985 с изменениями)