Гемиглобинцианидным методом

Принцип: Основный буферный раствор разрушает эритроциты, а феррицианид калия K₃[Fe(CN)₆] = красная кровяная соль, окисляет до трёхвалентного состояния атом Fe²⁺ гема гемоглобина = Нb. Возникший гемиглобин (Нi), или, по старой номенклатуре - метгемоглобин, реагирует с ацетонциангидрином:

с образованием гемиглобинцианида, имеющего стабильный максимум абсорбции при λ 540-546 нм, пропорциональный содержанию Hb в пробе. Метод общепринят в мировой лабораторной прак-тике, как наилучший по сочетанию параметров. Нормальное содер-жание Нb в крови женщин составляет: 115 – 145 г/л, а мужчин: 132 – 164 г/л. Выпускаемые промышленностью моделигемоглобинометров, обычно основаны на том же принципе фотометрии, но имеют суженный диапазон, соответствующий максимуму А гемиглобинцианида.

Ход определения: В маркированную пробирку внести точно 5 мл трансформирующего раствора, содержащего нужные пропорции буфера, феррицианида калия и ацетонциангидрина. Затем, с помощью полуавтоматического дозатора, туда же добавить 20 мкл крови (Разведение в 251 раз). Полученной смесью многократно промыть наконечник дозатора и тщательно перемешать раствор. Пробирку оставить в штативе не менее чем на 10 мин.

Декантировать пробу в кювету ФЭКа, толщиной 10 мм и при зеленом светофильтре, против трансформирующего раствора, измерить А. Рассчитать концентрацию гемоглобина (г/л) в крови по формуле: А ^.367,7, занести результат в протокол и сделать выводы.

4.3.3. Определение количества эритроцитов в крови с помощью турбидиметрии

Принцип метода: Многократное разведение нативной крови с антикоагулянтом, изоосмотическим раствором с физиологическим рН, делает суспензию эритроцитов относительно стабильной и прозрачной. Это позволяет, при максимально возможной λ ФЭКа, сочетать минимум поглощения энергии света с его максимальным рассеянием, клетками соизмеримого диаметра.

Ход определения:

1. Подготовить в штативе ряд из 7 маркированных пробирок.

2. С помощью мерных пипеток, внести в первую пробирку точно 4 мл, а в остальные – по 2 мл 0,85 % раствора хлорида натрия = физиологический раствор, с рН = 7,36.

3. Полуавтоматическим дозатором на 20 мкл внести в первую пробирку 2 объема (40 мкл) цельной крови. Многократно промыть наконечник дозатора полученной суспензией, тщательно перемешивая ее.

4. С помощью мерной пипетки, перенести из первой пробирки во вторую точно 2 мл суспензии и снова, тщательно ее перемешать.

5. Повторять операцию «переката», перенося точно по 2 мл суспензии и тщательно перемешивая вновь полученную, из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки, 2 мл суспензии слить в отходы.

6. Вращая рукоять на передней панели ФЭКа слева, установить красный светофильтр и, соответственно пп. 2 и 3 работы 4.3.1, убедиться в соответствии положения рукояти его чувствительности на передней панели справа.

7. Начиная с самой разбавленной пробы (пробирка 7) поочередно декантировать содержимое пробирок в кювету толщиной 5 мм и, замерив их абсорбцию против дистиллята или физраствора, занести результаты в таблицу 4.4 протокола опыта.

Таблица 4.4

Анализ серии растворов

8. Рассчитать серии разведений крови, полученных методом «переката».

9. Вычертить график зависимости между разведением проб (абсцисса) и абсорбцией (ордината), определив на нем линейный отрезок разведений, пригодных для счета эритроцитов по степени мутности растворов.

10. Если параллельно, с помощью эталонной микроскопии в камере Горяева, подсчитать содержание эритроцитов в исходном образце крови и разведенных пробах, можно заполнить последнюю строку в таблице 4.4. Соответственно, внеся нужные поправки, удастся построить аналогичный разбавлению калибровочный график, таблицу или простую компьютерную программу, для автоматического счета эритроцитов в разбавленных образцах крови. В частности, так построена калибровочная таблица лаборатории, по которой можно определить содержание эритроцитов в 1 мкл и, соответственно, в 1 л крови исследуемого образца.

11. Сделать выводы из эксперимента, учитывая, что нормальное содержание эритроцитов в крови женщин: 3 – 4,5 ^х 10¹²/л, а мужчин: 4 – 5,5 ^х 10¹²/л.

12. Пара студентов, завершающая фотометрию, оставив открытой крышку кюветного отделения ФЭКа, тумблером на задней панели слева, выключает прибор и вынимает его сетевую вилку из розетки.

13. Слив растворы из кювет, тщательно вымыть их изнутри и снаружи дистиллятом и, оставить вверх дном на фильтре. После чего, убрать рабочее место и сдать его лаборанту.