D градієнтний NOESY

Ми вже раніше згадували про те, що однією з популярних методик нестаціонарного ЯЕО є методика 1D NOESY. Незважаючи на те, що її назва близька до відповідної двомірної методики, це є цілком самостійний експеримент, що використовує специфічну імпульсну послідовність. При застосуванні він дає результати, що дуже схожі на ті, які можна отримати за допомогою різницевої спектроскопії, але потребує менше часу. Крім того, спектри 1D NOESY позбавлені артефактів віднімання, що характерні для різницевих спектрів.

Сьогодні найбільш досконалим є експеримент, заснований на двохімпульсній градієнтній спіновій луні, DPFGSE, (Рис. 4.17б). Він дозволяє селективно рефокусувати намагніченість обраного спіна, у той час, як інші сигнали залишаються розфазованими і у спектрі не спостерігаються. Послідовність починається з неселективного 90^о імпульсу, який переводить в поперечну площину вектори намагніченості всіх протонів. Далі в послідовності містяться два елементи градієнтної спінової луни, що являють собою комбінацію селективного 180^о імпульсу на протонах та двох градієнтних імпульсів, що подаються до і після селективного імпульсу. Дія першого з градієнтів фрагменту градієнтної луни приводить до повного розфазування всієї намагніченості, що існує в поперечній площині. Селективний імпульс вибірково інвертує компоненти намагніченості, що відповідають сигналу, з якого переноситься ЯЕО. Наступний градієнтний імпульс, що точно відповідає попередньому, рефокусує цю намагніченість. Таким чином, маємо ефект селективного рефокусування обраного сигналу при повному розфазуванні всіх інших. Другий елемент градієнтної спінової луни використовується для більш повного розфазування всіх сигналів і більш точного виділення зі спектру обраного сигналу. В ньому використовуються два однакових градієнти, що відрізняються за амплітудою від попередніх. Це робиться, щоб унеможливити рефокусування намагніченості, що була розфазована попередньою спіновою луною. Фрагмент з двох послідовних градієнтних спінових лун називається скульптурним збудженням. Він широко використовується для підвищення селективності збудження, або інвертування сигналів. Наступний 90^о імпульс розташовує обраний вектор намагніченості уздовж осі –z, що приводить до наростання ЯЕО протягом наступного періоду змішування, t_m. Істотною відмінністю від експериментів ЯЕО, що обговорювалися раніше, є те, що в даному випадку за час періоду змішування, t_m, виникають лише ЯЕО, а всі вихідні сигнали виявляються розфазованими і в спектрі не виникають. Додатковий очищувальний імпульс G_m використовується для видалення з поперечної площини залишкових компонентів намагніченості. На сигнал, що насичується цей імпульс не впливає, оскільки він в момент подачі імпульсу розташований вздовж осі –z. Після звичайної вибірки одержуємо спектр, у якому є тільки інвертований сигнал, що опромінюється, і сигнали ЯЕО, пов'язані з його насиченням. Одержання різницевого спектра при цьому непотрібне. Таким чином, можуть бути отримані спектри високої якості, що не містять дефектів різницевої спектроскопії. Це є вагомою перевагою перед описаними раніше методиками. Дана методика є також досить швидкою, оскільки відпадає необхідність тривалого накопичення сигналу для усереднення артефактів віднімання. Оптимальним у цьому випадку є також і динамічний діапазон приймача.

Рис. 4.26.Схеми ID NOESY. Базова схема (a) вимагає для виявлення ЯЕО застосування різницевої спектроскопії, тоді як метод із градієнтним відбором DPFGSE-NOE (б) дає можливість одержати ЯЕО без викривлень, пов'язаних з різницевими артефактами.

На практиці релаксаційні процеси, які мають місце під час періоду t_m, можуть викликати небажане фазування компонентів намагніченості, внаслідок чого в кінцевому спектрі з невеликою інтенсивністю можуть проявитися всі наявні сигнали. Для того, щоб інтенсивність таких сигналів була якнайменшою, в імпульсну послідовність вводиться один або два 180^о імпульси (одночасно із градієнтними очищувальними імпульсами). Сигнали, що залишилися після цього, легко видаляються зі спектра за допомогою фазового циклу (EXORCYCLE). Таким чином, на відміну від звичайної різницевої спектроскопії де проводиться віднімання інтенсивних сигналів, у нашому випадку доводиться видаляти зі спектра лише невеликі залишкові сигнали. Для малих молекул і молекул середнього розміру, коли тривалість періоду змішування становить близько 500 мс, показано, що для видалення фонових сигналів достатньо під час t_m подавати один імпульс, що інвертує намагніченість. Якщо ж тривалість періоду змішування становить 1,5 с, то слід подавати два таких імпульси.

Для J-зв'язаних спінів, як і у випадку експериментів по стаціонарному різницевому ЯЕО, можуть виникати артефакти, пов'язані з ефектом SPT і ZQC-піки, що описані для NOESY. Для їхнього видалення зі спектра використовуються спеціальні методики. Великою перевагою градієнтного підходу є можливість спостерігати за його допомоги далекі ЯЕО. У різницевих експериментах такі ефекти або не проявляються, або їх неможливо спостерігати в присутності артефактів віднімання. Наявність сильної скалярної взаємодії між такими віддаленими спінами, не супроводжується ускладненнями, що пов'язані з ССВ, тому для його спостереження застосовується звичайна градієнтна послідовність, яка наведена на Рис. 4.26б. Типовий результат такого експерименту для малого біциклічного лактаму 4.14 наведений на Рис. 4.27. Селекція кожного сигналу здійснювалася за допомогою селективного 180^о Гаусового імпульсу тривалістю 40 мс. Під час періоду змішування тривалістю 800 мс подавалися два неселективних 180^о імпульси. Кожний спектр є результатом накопичення протягом 12 хв. сигналу від зразка масою 10 мг. Як видно, спектри з успіхом можна використовувати для якісних стереохімічних висновків. Спостережувані сигнали пов'язані з ЯЕО та SPT-артефактами.

Рис. 4.27.Селективний 1D градієнтний NOESY спектр біциклічного лактаму 4.14,записаний з періодом змішування 800 мс. Спектр (a) являє собою звичайний одномірний спектр. Сильний гемінальний ЯЕО для сигналу H4'-H4 в (в) для збереження масштабу малюнка був усічений.