Системы культивирования клеток

1 Вторичные метаболиты – вещества, вырабатываемые растительными клетками, но не являющиеся необходимыми для их жизнедеятельности. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. Биотехнологическое производство вторичных метаболитов растений основано преимущественно на суспензионной культуре. В лабораториях при исследовании вторичного метаболизма in vit-ro суспензия обычно культивируется в колбах в небольших объемах (40- 200 мл) и перемешивается на круговых качалках. Скорость вращения сосудов (обычно 90-120 об/мин) может значительно влиять на рост и накопление метаболитов. Так, у клеток красавки и клена субоптимальные скорости качания снижали их рост, тогда как у клеток табака скорость вращения не влияла на рост, а высокие скорости даже увеличивали выход никотина.

При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешивание. Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования.

Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток.

Для культуры клеток женьшеня отрицательное влияние механического стресса при выращивании в ферментере с турбинными мешалками сказывалось на жизнеспособности клеток уже при скоростях мешалок свыше 100-350 об/мин, это отрицательно влияло на синтез ими антрахинонов.

Устойчивость штамма к механическому стрессу является важным требованием к культуре и трудной задачей для исследователей. Мягкое перемешивание и аэрацию обеспечивает пневматический способ перемешивания потоком сжатого стерильного воздуха, подаваемого в ферментер с восходящим током воздуха. К сожалению, и этот способ имеет свой недостаток, потому что в культуральной среде возникает избыток воздуха, приводящий к кислородному голоданию. От концентрации кислорода в среде зависят рост и вторичный метаболизм клеток.

В микробиологических системах изучена взаимозависимость роста биомассы, выхода искомого продукта и снабжения кислородом. Для растений таких данных нет. На рост клеток, кроме кислорода, могут влиять и другие газы. Например, углекислый газ может существенно влиять на длину лаг-фазы. Высокая степень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекислый газ и летучие соединения. Клетки растений сравнению с микроорганизмами имеют низкую интенсивность дыхания, что тоже должно учитываться при конструировании сосуда для культивирования.

Сравнивали рост и образование метаболитов клетками в ферментерах разных типов. Клетки моринды лимонолистной, культивируемые в ферментерах с продувкой воздуха, содержали антрахинона на 30 % больше, чем в перемешиваемых колбах, и два раза больше, чем в ферментерах других систем. Выход биомассы клеток не менялся в зависимости от типа биореактора. Клетки барвинка розового (Catharantus roseus) также синтезировали больше индольных алкалоидов при культивировании в ферментере с продувкой воздуха, чем в биореакторах с механическим перемешиванием.

Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений – высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, сопровождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии. Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения.

В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку» или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце в концов может привести культуру к гибели.

Клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время генерации (интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями) растительной клетки в 60-100 раз превосходит время генерации микробной клетки. Пул пролиферирующих клеток не превышает 50-60 % , многие клетки быстро прекращают деление и переходят в фазу покоя Go.

Все эти обстоятельства определяют продолжительный рост популяции клеток при накопительном, или периодическом, выращивании. Поддержание стерильности длительное время также является одной из технических проблем, особенно при непрерывном культивировании. Периодическое или накопительное культивирование – это самый простой способ выращивания клеток, являющийся пока традиционным.

Все изложенные специфические особенности растительных клеток затрудняют возможности крупномасштабного культивирования в непрерывном режиме, хотя в перспективе, видимо, переход к нему произойдет. Особенно для тех культур, у которых синтез четко коррелирует с ростом: на первой стадии культивирования идет накопление биомассы, на второй – синтез продукта, ради которого и проводится культивирование.

2 Каллусные культуры при поверхностном культивировании накапливают вторичных метаболитов больше, чем клетки, растущие в жидкой среде. Показано, что у многих видов растений компактные, медленно растущие каллусные ткани на агаризованной среде накапливают алкалоидов больше, чем рыхлые и быстро растущие культуры, то есть для нормального метаболизма необходима какая-то пространственная организация клеток. Положение клетки внутри организма является одним из факторов, определяющим степень и тип ее дифференциации. Клетки, растущие изолированно друг от друга и в виде агрегатов, имеют совершенно различные условия окружения и, как следствие этого, различные пути метаболизма. Можно предположить, что чем ближе клетка или группа клеток по уровню организации к целому растению, тем более вероятно, что в них будут реализовываться метаболические пути, характерные для целого организма. Имеющиеся в литературе данные о положительной корреляции между накоплением вторичных метаболитов и степенью дифференцировки в культурах клеток подтверждают это. В связи с этим в последнее время усилился интерес к иммобилизованным клеткам.

Иммобилизация (создание неподвижности) клеток обеспечивает условия, приводящие к дифференциации, и способствует увеличению выхода вторичных веществ. Метод иммобилизации позволяет клеткам расти в тесном физическом контакте друг с другом. Когда клетки контактируют между собой, в их массе, как в интактном организме, устанавливаются определенные химические и физические градиенты, регулирующие метаболизм и процессы дифференциации. Это градиенты регуляторов роста, питательных веществ, кислорода, углекислоты.

Клетки могут быть иммобилизованы 4 способами: 1) иммобилизация в инертном субстрате, то есть обволакивание клеток одной из различных цементирующих сред (альгинат, агар, полиакриламид, коллаген или комбинация гелей); 2) адсорбция клеток на инертный субстрат; 3) адсорбция клеток на инертный субстрат с помощью биологических макромолекул (лектины); 4) ковалентное связывание клеток с каким-либо инертным субстратом типа карбоксиметилцеллюлозы.

Чаще применяются первые два способа. Клетки, прикрепленные к биологически инертному субстрату, сохраняют жизнеспособность. Вокруг физичес-ки неподвижных иммобилизованных клеток могут циркулировать большие объемы питательной среды, регулируя состав которой, замедляют рост клеток и тем самым повышают выход вторичных продуктов.

Иммобилизованные клетки необходимо снабжать в большом количестве предшественниками, но в низких концентрациях. Эти предшественники должны быть как можно ближе к искомому продукту в цепи биосинтезов. Поскольку клетки в иммобилизованном виде культивируются длительное время, то для этого используются клетки, которые сами, естественным путем, секретируют необходимые метаболиты в питательную среду или могут быть индуцированы к такой секреции какими-либо приемами, например воздействием низких температур и растворителей. Клетки, которые накапливают искомый продукт внутри, например в вакуолях или пластидах, непригодны для иммобилизации. Извлечение продукта из омывающего клетки раствора – тоже нелегкая проблема с точки зрения экономичности производства.

Если иммобилизованные клетки предназначаются для промышленного использования, важную роль играет выбор типа биореактора, в котором они будут культивироваться. По-видимому, более удобной будет колоночная культура, поскольку при этом экономится пространство и облегчается контроль за током питательных веществ через клетки, в случае надобности улучшается освещенность культуры. Клетки некоторых видов растений, как было отмечено выше, для обеспечения уровня метаболизма, близкого к происходящему в клетках интактного растения, требуют света.

Иммобилизованные клетки могут быть использованы не только для синтеза, но и для биотрансформации различных соединений. Их преимущество состоит в том, что благодаря увеличению срока функционирования клеток в иммобилизованном состоянии удешевляется процесс биокатализа. А.Альферманн с сотрудниками провели следующий опыт. Они культивировали клетки наперстянки шерстистой (Digitalis lanata), окутанные альгинатным гелем (50 шариков диметром 4-5 мм), в 100 –миллилитровых колбах Эрленмейера в 25 мл среды. Среду с субстратом меняли каждые три дня. В качестве субстрата добавлялся b- метилдигитоксин, который трансформировался клетками в b- метилдигоксин. В таких условиях культивирования клетки осуществляли биотрансформацию субстрата в продукт с постоянной скоростью в течение 170 суток. Сердечный гликозид дигоксин обладает большим терапевтическим эффектом по сравнению с дигитоксином, которого в растениях содержится значительно больше. Дигоксин отличается от дигитоксина лишь по дополнительной гидроксильной группе на двенадцатом атоме углерода. Недифференцированные культуры клеток наперстянки шерстистой не образует сердечных гликозидов, но могут осуществлять определенные реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду.

Итак, следует подчеркнуть те преимущества, которые имеют иммобилизованные клетки по сравнению с суспензионными культурами:

- многократное использование биомассы путем сохранения клеток в биореакторе и выделения продукта из среды;

- физическое отделение клеток от среды;

- культивирование большого количества биомассы в сосудах небольшого объема;

- длительность культивирования;

- возможность эффективной биотрансформации веществ.

3 Производственная технология требует соответствующей аппаратуры, которая располагает, в частности, Япония. Так, в 20000-литровом ферментере в непрерывной культуре в течение трех месяцев выращивались клетки табака, продуцировавшие убихинон с продуктивностью по биомассе 5,582 г/л в день. Там также налажено крупномасштабное производство и других вторичных метаболитов.

В н.в. в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них – женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, белладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, амми зубная, мак снотворный и др.

Таким образом, растения содержат разнообразные вещества вторичного метаболизма, которые широко используются в медицине и народном хозяйстве. Клетки in vitro способны синтезировать эти вещества и независимо от факторов окружающей среды служить их источником круглый год.

Таблица 2

Промышленное производство вторичных метаболитов

на основе культуры тканей растений в Японии

Продукт Растения Применение
шиконин убихинон-10 аймалицин камптотецин   берберин     антоциан воробейник аптечный табак барвинок розовый камптотека остроконечная коптис японский     цветочный сбор, виноград ожоги, порезы кожные заболевания болезни сердца противоопухолевое средство бактерициды, средство от расстройства кишечника пигмент    

Культивируемые клетки способны осуществлять биотрансформацию, то есть синтезировать некоторые вещества из их дешевых и доступных предшественников. Факторами, влияющими на накопление клетками in vitro вторичных веществ, являются генотип растения, состав питательной среды, условия культивирования.

Биотехнологическое производство экономически важных веществ растений основано преимущественно на суспензионной культуре, которая выращивается в многолитровых ферментерах. Однако такие особенности растительных клеток, как наличие жесткой и хрупкой стенки, большой вакуоли, различные размеры на разных этапах роста, осложняют их культивирование в таких ферментерах. Для клеток, которые секретируют нужные метаболиты в питательную среду, применяют иммобилизацию в основном путем обволакивания инертными субстратами либо путем адсорбции на этот субстрат. Иммобилизованные клетки увеличивают выход вторичных веществ и дольше культивируются. Из омывающего клетки питательного раствора извлекаются искомые продукты.

Для создания клеточной технологии необходимо получение продуктивной и стабильной в генетическом отношении клеточной линии. Продуктивность клеток стимулируется мутагенезом и клеточной селекцией. Важно, чтобы клетки не утратили свой биосинтетический потенциал при переносе из условий лабораторного эксперимента в небольших колбах в условия промышленного выращивания в объемных ферментерах. Технологии промышленного культивирования клеток требует развития фундаментальных знаний по биологии клетки и биосинтезу вторичных веществ, а также больших капиталовложений на первых порах.

 









Дата добавления: 2015-07-14; просмотров: 1958; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию, введите в поисковое поле ключевые слова и изучайте нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам понравился данный ресурс вы можете рассказать о нем друзьям. Сделать это можно через соц. кнопки выше.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2020 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.018 сек.