Клональное микроразмножение растений

1 Живые клетки самых различных специализированных тканей, помещенные на питательную среду в стерильных условиях, могут реализовать свою тотипотентность и дать начало целому растению. Способность отдельных клеток восстановить целый организм, обладающий всеми признаками исходного растения, успешно используется для клонального размножения.

Клон (от греч. сlon – отпрыск, ветвь) – растение, полученное путем бесполого, то есть вегетативного размножения. Клоны идентичны материнскому растению и между собой. Клональное микроразмножение – это массовое бесполое размножение в культуре клеток и тканей, при котором возникшие растения генетически идентичны исходному экземпляру.

Клональное микроразмножение имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными методами вегетативного размножения:

1. Высокий коэффициент размножения. Так, из одного растения герберы, земляники, хризантемы, розы при размножении их посредством культуры тканей можно получить в год свыше 1 млн растений. Из одной почки яблони за 8 месяцев культуры можно получить до 60 тыс. побегов. При культивировании меристемы куста малины in vitro удается получить до 50 тыс. растений в год. Культура меристемы персикового миндаля, который служит подвоем для прививок и с большим трудом размножается при использовании традиционных методов, позволяет получить 1 млн растений в год. Таким образом, коэффициент микроразмножения в несколько тысяч раз больше, чем при использовании обычных методов вегетативного размножения.

2. Одновременно с микроразмножением происходит оздоровление растения от вирусов и патогенных микроорганизмов.

3. Ускорение селекционного процесса. Сроки получения товарной продукции новых сортов сокращаются до 2-3 лет вместо 10-12.

4. Методом культуры тканей возможно размножение растений, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, например пальмы. Так, методом клонального микроразмножения в промышленных масштабах размножается масличная пальма.

5. Экономичность. При микроразмножении экономятся площади теплиц.

6. Получение молодых растений (омоложение старых особей).

7. Можно поддерживать рост круглый год, что важно для растений, имеющих в цикле развития периоды покоя.

2 Существуют различные методы клонального микроразмножения, которые разные авторы классифицируют в зависимости от характера морфогенетических процессов, реализуемых эксплантами в культуре тканей. Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко предлагает принципиально новую классификацию методов, которая отличается от других тем, что в ее основу положены различия между растениями, образовавшимися в культуре из предсуществовавших и вновь возникших инициалей.

Первый тип растений получается в результате активации существовавших в интактном растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля). Эти растения, возникшие из меристем, генетически полностью идентичны родительским формам, так как апексы в условиях культуры в большинстве случаев генетически стабильны.

Второй тип растений получается в результате индукции возникновения почек или эмбриоидов. Эти растения, полученные из специализированных и каллусных клеток, характеризующихся генетической изменчивостью в культуре, могут несколько отличаться от родительских. Таким образом, этот метод можно применять только к тем растениям, у которых каллус отличается генетической стабильностью или вариабельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости.

Почки или эмбрионы могут возникать: 1) непосредственно из специализированных тканей экспланта (тканей репродуктивных органов, эпидермиса, субэпидермальных тканей, мезофилла листа и т.д. ); 2) из первичного каллуса, образованного клетками экспланта; 3) из пересадочной каллусной ткани или клеток, растущих в суспензионной культуре.

Рассмотрим конкретные морфогенетические реакции, вследствие которых образуются растения.

3 Процесс клонального микроразмножения проходит 4 этапа (рис. 9 ):

I этап. Введение экспланта в культуру. На этом этапе необходимо получить свободную от инфекции культуру, добиться выживания ее на питательной среде и быстрого роста экспланта. Успех зависит от правильного выбора экспланта с учетом условий выращивания и фазы развития донорного растения.

II этап. Собственно микроразмножение. Образование побегов и увеличение их числа.

III этап. Укоренение размноженных побегов и их хранение (депонирование). Необходимо обеспечить развитие нормальной корневой системы. Для этого в питательную среду добавляют ризогенный фактор – ауксины. После появления корней растения либо подготавливают к высадке в почву, либо помещают на хранение при пониженных температурах (депонирование). Это задерживает развитие растений и позволяет сохранить их длительное время, используя затем по мере надобности.

IV этап. Высадка растений в почву. Растения подготавливают к высадке в грунт, повышая влажность воздуха и увеличивая интенсивность освещения. Растения с гетеротрофного питания переходят на автотрофное. Это очень важный этап, который требует тщательности и обеспечивает успех всей работы, вместе с тем именно здесь бывают большие потери.

Основной сложностью технологии на первом этапе для ряда растений является возможность ингибирования ростовых процессов экспланта токсическими веществами, выделяемыми им в среду. Хороший эффект дает отмывка экспланта антиоксидантом – аскорбиновой кислотой, а также добавление ее в питательную среду. Для некоторых древесных растений основные трудности при осуществлении технологии связаны с третьим этапом.

4Генотип растения во многом определяет успех работы по микроразмножению, так как скорость регенерации растений in vitro зависит от вида. Так, двудольные травянистые растения обладают более выраженной способностью к регенерации, чем однодольные и древесные растения. Для каждого вида растения подбирается наиболее эффективный метод регенерации. Растения, из которых изолируют экспланты, должны быть здоровыми, их выращивают в теплицах при невысокой влажности воздуха, с ограниченным поливом, избегая забрызгивания листьев. Лучше всего изолировать экспланты из асептических проростков, выращенных в стерильных сосудах.

Практически любую часть растения можно успешно культивировать in vitro и получить регенеранты, если эксплант отобран на соответствующей стадии развития. Выбор экспланта играет очень важную роль. Лучше всего использовать меристематические активные ткани и органы: верхушки побегов, пазушные почки, меристемы. Они хорошо выживают в культуре, обладают высокой скоростью роста и тотипотентностью.

Чем моложе растение – источник экспланта, тем выше регенерационная способность каллуса, полученного из него. Наибольший морфогенетический потенциал наблюдается у каллусной ткани, сформировавшейся из экспланта, выделенного из растений ювенильного возраста, т.е. проростков. Физиологический возраст экспланта сказывается не только на скорости развития, но и на его морфогенетической реакции, в смысле возможного пути морфогенеза in vitro. Например, у эчеверии элегантной на эксплантах из молодых листьев возникали преимущественно корни, из старых листьев - побеги, а из средних по возрасту листьев – и корни, и побеги. Орган, из которого изолируется эксплант, тоже имеет немаловажное значение для микроразмножения растений. Морфогенная способность экспланта зависит также от его размеров. Чем меньше эксплант, тем слабее проявляется в каллусе способность к органогенезу. Чем крупнее эксплант, тем выше генетическая стабильность, но зато возрастает возможность сохранения в его клетках вирусов. Поэтому на практике подбирают средние размеры эксплантов.

Важное значение имеет питательная среда. Среда Мурасиге – Скуга, наиболее часто используемая для микроразмножения, благоприятна для индукции и роста каллуса. На первом этапе микроразмножения в состав питательной среды часто вводят антиоксиданты (цистеин, глутатион, аскорбиновая кислота), которые предупреждают активацию гидролитических ферментов и гибель эксплантов.

Используя однотипную среду для культивирования и варьируя концентрации и типы регуляторов роста, можно направлять путь морфогенеза. При введении экспланта в культуру и собственно микроразмножении используются среды более богатые по составу, тогда как на этапе укоренения применяются менее сложные по составу среды, например минеральная среда Уайта, разбавленная среда МС. Ответственным моментом является последний этап работы - пересадка растений в грунт. Иногда укорененные растения пересаживают на жидкую питательную среду для лучшего образования корневых волосков. Через неделю их высаживают в автоклавированную почвенную смесь и накрывают стеклянными сосудами для поддержания высокой влажности, которые снимают через 7-10 дней. Если позволяют условия, то высаженные из пробирок растения первое время выращивают в камерах с повышенной влажностью. Но не для всех культур данные процедуры являются обязательными.

Из физических факторов наиболее важными являются свет и температура. Для процессов морфогенеза не требуется интенсивного освещения 1000-3000 лк с фотопериодом 14-16 часов. Когда растения подготавливают к пересадке в почву, их освещают светом до 10000 лк, так они проходят адаптацию к свету. Оптимальная температура для большинства растений примерно равна 25 ^оС. Однако следует учитывать температурные требования, характерные для данного вида растений в природе. Например, для луковичных температурный оптимум составляет 18 ^оС, а для монстеры - 30 ^оС.

Очень важное значение для получения in vitro полноценных растений имеет водный режим. С нарушением водного обмена растений связано также явление, как витрификация, также называемое «стекловидность», «впитывание». У растений клетки разбухают, утолщаются стебли, удлиняются и искривляются листья, они становятся прозрачными. Эти морфологические изменения сопровождаются снижением сухой массы листьев, уменьшением содержания белка, хлорофилла, целлюлозы, лигнина и увеличением содержания калия. В листьях увеличивается водное пространство и снижается газовое свободное пространство. Постепенно витрифицированные растения погибают. Особенно часто витрификация наблюдается у растений, культивируемых на жидкой среде. Когда побеги или черенки культивируют на жидкой среде, вода легко проникает в них через срез и заполняет все свободное газовое пространство. Поскольку у растений in vitro отсутствует транспирация, в них накапливается избыточная вода и они ею перенасыщаются. Изменение водного потока через растение отрицательно сказывается на поступлении питательных веществ.

Х. Геринг с сотрудниками показали, что, если снизить относительную влажность воздуха в культуральных сосудах, у растений восстанавливается транспирация и сильно уменьшается витрификация. Другие исследователи причиной витрификации считают не высокий водный потенциал среды, а избыток ионов аммония и цитокинина в питательной среде, а также биосинтез этилена культивируемыми тканями. Однако Х. Геринг показал, что морфологические изменения у растений, развивающиеся под воздействием повышенной концентрации цитокининов в среде и сопровождающиеся повышением в растениях содержания хлорофилла, не имеют ничего общего с явлением витрификации. Что касается повышения образования этилена, то это, по-видимому, свойственно витрифицированным растениям, а не является первопричиной витрификации. По мнению Кеверса, улучшение газообмена в культуральных сосудах и прменение циркулирующих сред с контролируемым содержанием NH₄⁺ и цитокининов ведет к преодолению витрификации.

Таким образом, эффективность клонального микроразмножения растений может ограничиваться различными факторами, отрицательное влияние которых можно снизить путем совершенствования метода.

5Метод клонального микроразмножения имеет большие преимущества, вместе с тем он является трудоемкой и дорогостоящей процедурой, поэтому в настоящее время его применение в промышленных масштабах ограничено. Технология клонального размножения in vitro на лабораторном уровне разработаны в мире более чем для 2400 видов растений, однако метод чаще всего используется для растений, с трудом размножаемых обычными методами, а также для решения задач, связанных с селекцией или с фундаментальными исследованиями, а именно:

1. Быстрое эффективное размножение отдельных генотипов или новых перспективных сортов.

2. Получение и эффективное размножение линий для производства гетерозисных гибридных семян.

3. Размножение ценных элитных растений с целью получения генетически идентичного потомства, например единичных гаплоидных растений или сконструированных методами клеточной и генной инженерии.

4. Быстрое получение и дальнейшее размножение свободного от вирусов и патогенных микроорганизмов посадочного материала плодоовощных полевых и декоративных культур.

5. Сохранение редких и исчезающих видов растений. Так, И.Р. Рахимбаев с сотрудниками разработали приемы вегетативного размножения редких видов шафрана, луков, лилии, гладиолуса, нарцисса. Это способствует сохранению и воспроизводству фонда редких и исчезающих видов и позволяет быстро размножить уникальные сорта декоративных растений.

6. Размножение ценных культурных и дикорастущих пород с низким коэффициентом размножения, семенное потомство которых расщепляется, а вегетативное размножение обычными способами происходит очень медленно.

7. Метод клонального размножения может быть также применен для массового получения «искусственных семян». Эмбриоиды, получаемые в суспензионной культуре, могут оказаться более удобными при автоматизации процессов микроразмножения, чем культивируемые побеги или регенеранты.

Клональное микроразмножение применяется для разведения декоративных (орхидеи, гвоздики, нарциссы, розы, фрезии, гиацинты, сирень), овощных (картофель, лук, чеснок, томаты овощных ()здики, нарциссы, розы, фрезии, гиацинты, сиреньоративных ()но. размножение, семенное потомство которых расщепляетс), плодово-ягодных (земляника, малина, смородина, виноград, яблоня, вишня) культур. Среди злаковых этим методом размножают в промышленных масштабах только сахарный тростник и бамбук. Злаковые травы и зерновые культуры размножаются in vitro с трудом, и этот метод используется в селекционных работах в небольших масштабах.

Преимущества клонального микроразмножения так очевидны и возможности его применения в растениеводстве и селекции растений настолько велики, что нет сомнений в том, что в ближайшем будущем широкое развитие получит биотехнология производства посадочного материала.